小構(gòu)樹總黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化、美白活性

張意笠，胡培豪，黃 真，程汝濱，鐘曉明

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

小構(gòu)樹Broussonetia kazinokiSieb.et Zucc.為桑科構(gòu)屬落葉灌木，別名楮皮、葡蟠、女谷等，主要分布在我國華東、華南地區(qū)及日本，資源豐富，在林業(yè)、農(nóng)業(yè)方面有廣泛應(yīng)用［1］。《中華本草》 記載，小構(gòu)樹葉具有清熱解毒、祛風(fēng)止癢、斂瘡止血等作用［2］；小構(gòu)樹根提取物被2015 年版《已使用化妝品原料名稱目錄》 收載，顯示出該植物在化妝品領(lǐng)域具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。

黃酮在植物界中廣泛存在，為色原烷或色原酮衍生物，是以α-苯基苯并吡喃酮為主體的一系列物質(zhì)總稱［3-4］，具有許多藥理活性，在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用［5］，王中曉［6］研究顯示，銀杏葉總黃酮對(duì)心肌缺氧性損傷有明顯保護(hù)作用；汪光華等［7］報(bào)道，從高良姜中提取純化得到的高良姜素、山柰素、山柰酚、槲皮素均對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用；方向等［8］從苦蕎萌發(fā)物中提取出苦蕎黃酮，發(fā)現(xiàn)它在整個(gè)紫外波段均有較強(qiáng)的吸收。另外，它也是構(gòu)屬植物主要化學(xué)成分之一，具有良好的生物活性。Lim等［9］發(fā)現(xiàn)，小構(gòu)樹根皮提取物異戊二烯型黃酮Kazinol U 可減少黑色素生成，改善色素沉著；賈東輝等［10］報(bào)道，構(gòu)樹葉醇提物中的成分主要為黃酮類，具有一定的抗氧化活性，并且存在量效關(guān)系。

目前，對(duì)構(gòu)屬植物的研究主要集中在構(gòu)樹，而對(duì)同屬成員小構(gòu)樹缺少相關(guān)報(bào)道。小構(gòu)樹為資源豐富、分布廣泛、來源廉價(jià)的藥用植物，但其總黃酮提取工藝落后，提取效率較低，同時(shí)尚無系統(tǒng)活性評(píng)價(jià)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化小構(gòu)樹總黃酮提取工藝，并評(píng)價(jià)該成分抗氧化、美白活性，以期促進(jìn)該資源和相關(guān)產(chǎn)品的深入開發(fā)利用。

1 材料

1.1 儀器 DZF 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；AL104 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；BLX-800 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）。

1.2 試劑與藥物 小構(gòu)樹根采自浙江省杭州市，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為桑科構(gòu)屬小構(gòu)樹Broussonetia kazinokiSieb.et Zucc.的干燥根。蘆丁對(duì)照品（B20771-100 mg，純度≥98%，批號(hào)T27F10Z81699）、1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（S30629-250 mg，純度 98%，批號(hào) W27F10E81251）、L-酪氨酸（S20087-25 g，批號(hào) J30M10R84464）、L-多巴（S20191-25 g，批號(hào) O25M8K3214）、熊果苷（B21402-20 mg，純度≥98%，批號(hào)T17S6B1）（上海源葉生物科技有限公司）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）［酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司，批號(hào)54C1201V］；L-抗壞血酸（美國Sigma 公司，批號(hào)WXBB4747V）；酪氨酸酶（美國Worthington 公司，批號(hào)34A14699Y）。無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、過硫酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含有量測定 參考文獻(xiàn)［11］報(bào)道的方法。

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10.0 mg，75% 乙醇定容至10 mL，搖勻，即得（1.0 mg／mL）。

2.1.2 供試品溶液制備 小構(gòu)樹根粉碎后過50 目篩，精密稱取粉末1.0 g，加入20 mL 75% 乙醇，置于70 ℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 min，抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，定容至刻度，即得。

2.1.3 檢測波長選擇 取供試品、對(duì)照品溶液各1 mL，置于25 mL 比色管中，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻后靜置6 min，加10%Al（NO3）3溶液1 mL，混勻后靜置6 min，再加4% NaOH 溶液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，混勻，靜置15 min，在200～800 nm 波長處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)上述2 種溶液在510 nm 處均有最大吸收，故選擇其作為檢測波長。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL 對(duì)照品溶液于25 mL 比色管中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，以蒸餾水管溶液為空白，在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度（A）對(duì)溶液質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得回歸方程為A＝0.429 2X-0.003 6（R2＝0.999 5），在0.3～1.8 mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行測定6次吸光度，測得其RSD 為0.8%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取小構(gòu)樹根粉末1.0 g，共6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法每隔10 min 測定吸光度1 次，持續(xù)60 min，測得其RSD 為2.7%，表明溶液在60 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份含有量已知的小構(gòu)樹根粉末，精密加入等量蘆丁對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率為95.3%，RSD 為2.3%。

2.2 單因素試驗(yàn) 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%、65%、75%、85%、95%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，平行3 次，考察其對(duì)總黃酮得率的影響。

如圖1A 所示，總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而先升后降，在85% 時(shí)達(dá)到最大值，但當(dāng)其過高時(shí)可能會(huì)使一些醇溶性雜質(zhì)溶出增多，導(dǎo)致得率反而下降。如圖1B 所示，總黃酮得率隨著液料比增大而先升后略降，在30∶1 時(shí)達(dá)到最大值，但其繼續(xù)增加時(shí)得率反而略有降低，可能是由于其他非黃酮類可溶性雜質(zhì)溶出所致。如圖1C 所示，總黃酮得率隨著溫度升高而先升后降，在80 ℃時(shí)達(dá)到最大值，但當(dāng)其過高時(shí)可能會(huì)使黃酮類成分氧化變性，導(dǎo)致得率下降。如圖1D 所示，總黃酮得率隨著時(shí)間延長而先升后降，在90 min 時(shí)達(dá)到最大值，但提取時(shí)間過短，黃酮類成分溶出不足；提取時(shí)間過長，可能會(huì)使一些熱不穩(wěn)定成分遭到破壞，導(dǎo)致得率下降。

綜上所述，進(jìn)行響應(yīng)面分析的各因素水平分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、85%、95%，液料比20∶1、30∶1、40∶1，提取溫度70、80、90 ℃，提取時(shí)間60、90、120 min，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，液料比30∶1，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間90 min，總黃酮得率為52.36 mg／g。

圖1 各因素對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of various factors on total flavonoids yield

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）為影響因素，總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y）進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行擬合，得二階多項(xiàng)式方程為Y＝51.45+6.00A+3.48B+5.51C-0.031D+1.22AB-0.49AC+0.68AD+4.34BC-4.83BD+0.15CD-5.50A2-6.71B2-7.50C2-3.59D2，方差分析見表3。由此可知，決定系數(shù)R2＝0.982 2，修正相關(guān)系數(shù)＝0.964 4，模型F＝55.2，P＜0.000 1，表明模型有極顯著意義；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型與數(shù)據(jù)擬合程度良好；A、B、C、BC、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)總黃酮得率有極顯著影響（P＜0.000 1），各因素影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間。響應(yīng)面分析［12-13］見圖2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由此可知，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)90.67%，液料比36.03∶1，提取溫度85.20 ℃，提取時(shí)間79.64 min，總黃酮得率為55.64 mg／g，考慮到實(shí)際操作，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液料比35∶1，提取溫度85 ℃，提取時(shí)間80 min。進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總黃酮平均得率為55.14 mg／g，與預(yù)測值55.64 mg／g 接近，與單因素所得52.36 mg／g 比較提升了5.31%，表明工藝合理穩(wěn)定，可為后續(xù)相關(guān)規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 DPPH 自由基清除率測定 配制10、20、40、60、80、100、200、400、600、800 μg／mL 總黃酮提取物、L-抗壞血酸溶液，各取1 mL，加入5 mL 0.06 mmol／L DPPH 乙醇溶液，充分混勻后室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長處測定吸光度。以L-抗壞血酸為陽性對(duì)照，平行3 次，計(jì)算清除率，公式為清除率＝×100%（A0為1 mL 蒸餾水+5 mL DPPH 乙醇溶液時(shí)的吸光度，A1為1 mL樣品+5 mL DPPH 乙醇溶液時(shí)的吸光度，A2為1 mL 樣品+5 mL 無水乙醇時(shí)的吸光度），結(jié)果見圖3A。由此可知，隨著總黃酮提取物質(zhì)量濃度升高，其清除DPPH 自由基的能力逐漸增強(qiáng)，并存在一定量效關(guān)系，當(dāng)其質(zhì)量濃度為10 μg／mL時(shí)清除率僅6.88%，而為400 μg／mL 時(shí)達(dá)87.77%，IC50為151.70 μg／mL。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.4.2 ABTS 自由基清除率測定 參考文獻(xiàn)［14］報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。將7 mmol／LABTS 溶液與2.45 mmol／L過硫酸鉀溶液按1∶1 比例混合均勻，室溫避光下靜置過夜，制備ABTS 貯備液，在12～16 h 內(nèi)測定，其間用蒸餾水稀釋，使其在734 nm波長下的吸光度為0.700±0.020。

配制 60、80、100、200、300、400、600、800 μg／mL總黃酮提取物、L-抗壞血酸溶液，各取0.1 mL，加入3.9 mL ABTS 貯備液，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)10 min，于734 nm 波長處測定吸光度。以L-抗壞血酸為陽性對(duì)照，平行3 次，按“2.4.1”項(xiàng)下公式計(jì)算清除率（A0為0.1 mL 蒸餾水+3.9 mL ABTS 自由基工作液時(shí)的吸光度，A1為0.1 mL 樣品+3.9 mL ABTS 自由基工作液時(shí)的吸光度，A2為0.1 mL 樣品+3.9 mL 蒸餾水時(shí)的吸光度），結(jié)果見圖3B。由此可知，隨著總黃酮提取物質(zhì)量濃度升高，其清除ABTS 自由基的能力逐漸增強(qiáng)，并存在一定量效關(guān)系，當(dāng)其質(zhì)量濃度為60 μg／mL時(shí)清除率僅13.11%，而為600 μg／mL 時(shí)接近100%，IC50為242.20 μg／mL。

2.5 美白活性實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn) ［15］報(bào)道的方法。

圖3 樣品對(duì)DPPH、ABTS 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of samples on DPPH and ABTS free radicals

2.5.1 單酚酶抑制活性測定 在96 孔酶標(biāo)板上加入L-酪氨酸（2.5 mmol／L）溶液50 μL 及總黃酮提取物、熊果苷溶液（10、20、40、60、80、100、150、200 μg／mL）各25 μL，混勻后37 ℃下孵育10 min，加入酪氨酸酶（250 U／mL）溶液50 μL，混勻后37 ℃下孵育15 min，于475 nm 波長處測定吸光度。以磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）為空白對(duì)照，熊果苷為陽性對(duì)照，平行3 次，計(jì)算抑制率，公式為抑制率＝×100%（A1為無供試品溶液，但有酪氨酸酶時(shí)的吸光度；A2為既無供試品溶液，也無酪氨酸酶時(shí)的吸光度；A3為既有供試品溶液，也有酪氨酸酶時(shí)的吸光度；A4為有供試品溶液，但無酪氨酸酶時(shí)的吸光度），結(jié)果見圖4A。由此可知，隨著總黃酮提取物質(zhì)量濃度升高，其對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制能力逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性關(guān)系，當(dāng)其質(zhì)量濃度為10 μg／mL時(shí)抑制率僅42.51%，而為80 μg／mL 時(shí)達(dá)74.69%，并且抑制作用強(qiáng)于熊果苷，總黃酮提取物、熊果苷IC50分別為24.37、15.05 μg／mL。

2.5.2 二酚酶抑制活性測定 在96 孔酶標(biāo)板上加入L-多巴（2.5 mmol／L）溶液50 μL 及總黃酮提取物、熊果苷溶液（10、20、40、60、80、100、150、200 μg／mL）各25 μL，混勻后37 ℃下孵育10 min，加入酪氨酸酶（250 U／mL）溶液50 μL，混勻后37 ℃下孵育15 min，于475 nm 波長處測定吸光度。以磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）為空白對(duì)照，熊果苷為陽性對(duì)照，平行3 次，按“2.5.1”項(xiàng)下公式計(jì)算抑制率，結(jié)果見圖4B。由此可知，隨著總黃酮提取物質(zhì)量濃度升高，其對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制能力逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性關(guān)系，當(dāng)其質(zhì)量濃度為10 μg／mL 時(shí)抑制率僅43.74%，而為60 μg／mL時(shí)達(dá)68.98%，并且抑制作用強(qiáng)于熊果苷，總黃酮提取物、熊果苷IC50分別為15.64、14.50 μg／mL。

3 討論

目前，優(yōu)化植物黃酮提取工藝的方法主要有正交試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)、Box-Behnken 法等［16-17］，其中Box-Behnken 法精準(zhǔn)性高，可完善正交試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)等線性模型中存在的不足［18］，本實(shí)驗(yàn)采用該方法優(yōu)化小構(gòu)樹總黃酮提取工藝，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后得率較單因素試驗(yàn)提高了5.31%，可為后期相關(guān)大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。劉艷清等［19］發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)總黃酮提取量的影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度，而本實(shí)驗(yàn)為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞液料比＞提取時(shí)間，表明在提取黃酮類成分過程中影響較大的因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)，故后期可重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)得率的影響。此外，還可將響應(yīng)面優(yōu)化與超聲-微波提取、酶法提取、電磁裂解等新型提取方法相結(jié)合，從而進(jìn)一步提高得率。

圖4 樣品對(duì)單酚酶、二酚酶的抑制率Fig.4 Inhibitory rates of samples on monophenolase and diphenolase

桑科構(gòu)屬植物中黃酮種類豐富，已從構(gòu)樹葉、果實(shí)等部位分離得到多種該類化合物［20-22］。Yang等［23］發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹葉中的酚類成分具有良好的清除DPPH、ABTS 自由基能力；Jang 等［24］從構(gòu)樹根皮中得到具有抑制酪氨酸酶活性的成分，有著一定的美白研究價(jià)值；另外，構(gòu)屬植物在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、治療糖尿病、抑菌等方面也表現(xiàn)出了相關(guān)活性［25-26］。

當(dāng)前在國內(nèi)外植物化妝品研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑不僅與抗衰老有關(guān)，與美白、抗炎等也關(guān)系密切，多種具有清除自由基、抑制酪氨酸酶活性的天然成分已得到廣泛應(yīng)用。吳穎等［27］報(bào)道，抗氧化、抑制酪氨酸酶活性的強(qiáng)弱程度與桔梗、金盞菊、蒲公英、銀杏葉、茶葉中黃酮和總酚含有量高低順序基本一致，并以茶葉最強(qiáng)。另外，抗氧化劑對(duì)減少黑色素合成有重要影響，可能是通過阻斷或減弱酪氨酸酶活性、抑制酶表達(dá)所致，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小構(gòu)樹總黃酮在抗氧化、美白方面均顯示出良好的作用，提示自由基可能與其抑制酪氨酸酶活性的機(jī)理相關(guān)，后續(xù)可深入挖掘該成分在細(xì)胞、分子水平上的美白機(jī)制，以期為該植物綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。