基于代謝組學研究雷公藤甲素誘導HepaRG 細胞損傷的機制

邢 琦，謝 彤，馮 哲，周玲玲，朱華旭，周學平

（南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023）

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.中分離得到的環氧二萜內酯化合物，為其主要活性成分，具有抗炎、免疫調節、抗生殖和促凋亡等多種藥理活性［1］。但該成分在臨床使用中表現出了明顯的毒副作用，尤以肝毒性常見［2］。

近年來有研究表明，雷公藤甲素肝毒性在細胞水平表現明顯。姚金成等［3］觀察了雷公藤甲素對正常人肝細胞株L-02 的作用和對肝CYP3A、CYP2E1 蛋白表達的影響，發現隨著雷公藤甲素濃度提高和孵育時間延長，L-02 細胞受損程度加重，CYP3A 蛋白的表達受到抑制，而CYP2E1 蛋白表達增加，推測雷公藤甲素引起肝細胞毒性的機制與影響CYP450 酶系有關；尹亮等［4］探討了雷公藤甲素對人肝癌細胞HepG2 的作用和分子機制，結果顯示雷公藤甲素在體內外能誘導HepG2 細胞的凋亡，其機制可能與抑制HSP70 蛋白表達，增強caspase 級聯反應相關；劉春暉等［5］進一步研究了雷公藤甲素對HepG2 細胞的損傷作用，發現在肝毒性劑量下，雷公藤甲素能降低細胞中過氧化指標SOD、GSH-Px 酶的活力，引起自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1 表達增高，推測損傷機制可能為過氧化損傷和氧化應激誘發了過度的自噬。

代謝組學是一門研究內源性小分子代謝物變化規律的新興科學，隨著其深入發展，該技術在細胞水平的研究中展現出獨特的優勢。細胞代謝組學以細胞中具有高敏感性和高特異性的生物標志物為切入口，探索疾病發生、中藥毒性和中藥治療作用的機制。本實驗基于GC-MS 代謝組學技術檢測雷公藤甲素干預不同時間后HepaRG 肝細胞內代謝物的變化，篩選出雷公藤甲素致肝細胞損傷的生物標志物，從代謝通路的角度初步探索雷公藤甲素對肝細胞的毒性作用機制。

1 材料

1.1 細胞株 HepaRG 人源肝癌細胞購自上海紀寧實業有限公司，保存于南京中醫藥大學江蘇省兒童呼吸疾病（中醫藥）重點實驗室。

1.2 藥物與試劑 雷公藤甲素（批號150602）購自成都普菲德生物技術有限公司；1，2-13C-肉豆蔻酸（批號SH2326B）、N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（批號BCBW2670）、吡啶（批號 SHBJ7548）、甲氧胺鹽酸鹽（批號BCBW2927）購自美國Sigma-Aldrich 公司；正己烷（批號4A6004）購自美國ROE Scientific 公司；甲醇（批號10994607906）購自德國Merck 公司；RPMI-1640 培養基（批號8118167）、胎牛血清（批號42F5091K）、胰蛋白酶（批號2053591）購自美國Gibco 公司；甲基噻唑藍（MTT）（批號EZ3455C328）購自德國Biofroxx 公司；青鏈霉素混合液（批號20181110）、二甲基亞砜（DMSO）（批號1029B0313）購自北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號AD24464280）購自美國HyClone 公司。

1.3 儀器 AS 1310 自動進樣器、Trace 1310 氣相色譜儀、TG-5MS 氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、TSQ 8000 質譜儀、Savant SPD 1010 SpeedVac 真空濃縮儀（美國Thermo Fisher 公司）；Allegra 64R 高速冷凍離心機（美國 Beckman Coulter 公司）；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器（美國Scientific Industries 公司）；Infinite M200 PRO 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；MCO-20AZC 型CO2培養箱、超低溫冰箱（日本Sanyo 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法測定HepaRG 細胞存活率 使用1640完全培養基培養HepaRG 細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。選擇處于對數生長期，生長狀態良好的HepaRG 細胞，分為空白組、DMSO 組（1%DMSO）、雷公藤甲素組（2、0.4、0.08、0.016、0.0032 μg／mL），每組設6 個復孔，細胞濃度為6×104／mL，接種于96 孔板中，每孔加入180 μL 細胞懸液，約12 h 后細胞貼壁，加入藥物分別處理12、24、48 h，每孔加入0.5% MTT 20 μL 繼續培養，4 h 后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL。將96 孔板置于搖床上振蕩10 min，鏡下觀察結晶完全溶解后，于490 nm 波長酶標儀上測定各孔光密度值（OD），存活率＝ ［OD給藥組／OD空白組］×100%。重復3 次。

2.2 樣本收集 選擇處于對數生長期、生長狀態良好的HepaRG 細胞進行實驗，分為空白組、雷公藤甲素組（0.4 μg／mL），細胞濃度為5×105／mL，接種于6 孔板中，每孔加入1.8 mL 細胞懸液，約12 h 后細胞貼壁，雷公藤甲素組加入雷公藤甲素溶液200 μL（終質量濃度0.4 μg／mL），空白組加入1640 培養基溶液200 μL，分別處理12、24、48 h，PBS 沖洗2 次后迅速加入約3 mL 液氮進行淬滅，待液氮揮發后，加入300 μL 純水收集樣本，于-80 ℃冰箱中保存。

2.3 樣本前處理及衍生化 上述細胞經過-80 ℃冷凍60 min、37 ℃融化30 min 的3 次凍融循環后，渦旋30 s 以保證細胞分離。經離心濃縮儀揮干后加入450 μL 甲醇（含內標1，2-13C-肉豆蔻酸12.5 μg／mL），渦旋5 min 后離心（15 000 r／min）10 min，取400 μL 上清揮干。加入30 μL 甲氧胺吡啶溶液（10 mg／mL），渦旋5 min 后振蕩1.5 h（30 ℃，350 r／min），再加入30 μL BSTFA 溶液，渦旋5 min 后振蕩30 min（37 ℃，350 r／min），離心（4 ℃、18 000 r／min）10 min 后取50 μL 上清進樣。

2.4 GC-MS 分析條件

2.4.1 色譜條件 TG-5MS 氣相色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；載氣氦氣，體積流量1.2 mL／min；采用分流模式，分流比20∶1；進樣量1 μL，進樣口溫度250 ℃；起始溫度為60 ℃，保持1 min，以20 ℃／min 升高至320 ℃，保持5 min。

2.4.2 質譜條件 離子源為EI 電子源，電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度300 ℃；質譜掃描范圍m／z50～500；采集時間3.8～19 min。

2.5 數據處理及統計分析 運用GC-MS 技術采集圖譜信息，并導入MS-DIAL 軟件和NIST 數據庫中提取色譜峰及鑒定物質，得到代謝物名稱、組別、峰高的三維數據信息，以VIP ＞1.0、P＜0.05 為條件，篩選雷公藤甲素致肝細胞損傷的生物標志物。將三維數據信息導入SIMCA-P 13.0 軟件進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），建立PLS-DA 模型時應用置換檢驗來判斷模型是否發生過度擬合現象，避免監督性模型獲得結果的偶然性，通過多次隨機改變分類變量Y的排列順序（n＝200）建立模型以獲取隨機模型的R2和Q2值，Q2回歸直線與Y 軸的截距小于0，說明所建模型穩定性較好。使用PLS-DA 模型計算HepaRG 細胞樣本中各變量的變量投影重要性（VIP）值，根據VIP＞1.0 篩選不同時間點空白組和雷公藤甲素組之間的差異性代謝物。數據進行歸一化、log 轉化和Pareto 校準后進行單因素方差分析，根據P＜0.05 篩選差異性代謝物，選取同時滿足VIP＞1.0、P＜0.05 的代謝物作為生物標志物，經Metaboanalyst 4.0 網站（http：／／www.metaboanalyst.ca／）對數據進行代謝通路分析。

3 結果

3.1 雷公藤甲素對HepaRG 細胞存活率的影響 與空白組比較，隨著雷公藤甲素質量濃度增加、作用時間延長，HepaRG 細胞存活率出現明顯的下降趨勢；2、0.4 μg／mL 雷公藤甲素處 理HepaRG細胞12、24、48 h，細胞存活率均下降（P＜0.01），見圖1。后續實驗選擇0.4 μg／mL 雷公藤甲素進行研究。

圖1 雷公藤甲素對HepaRG 細胞存活率的影響Fig.1 Effect of triptolide on survival rate of HepaRG cells

3.2 GC-MS 分析 HepaRG 細胞總離子流圖（圖2）顯示，空白組和雷公藤甲素干預不同時間的HepaRG 細胞存在較多的色譜峰差異，提示細胞內部分代謝物的含有量發生了變化。

通過MS-DIAL 軟件和NIST 數據庫提取色譜峰及鑒定物質，根據代謝物名稱、組別、峰高等信息鑒定得到104 種代謝物，包括蘇氨酸、絲氨酸、異亮氨酸等氨基酸類，甘油酸、硬脂酸、棕櫚酸等脂肪酸類，麥芽糖、核糖、塔格糖等糖類，廣泛涉及氨基酸代謝通路、脂質代謝通路和糖代謝通路等。

3.3 代謝輪廓分析及差異代謝物的鑒定 將數據導入SIMCA-P 13.0 軟件構建PCA 模型，模型的得分圖見圖3A，R2X＝0.69，Q2＝0.495，說明所建模型能夠反映HepaRG 細胞的代謝輪廓。在PCA 得分圖上可以看出，干預不同時間點的雷公藤甲素組細胞樣本可以和空白組明顯分開。其中空白組、雷公藤甲素組12 h 細胞基本能夠和其他組別完全區分，空白組24、48 h 與雷公藤甲素組24、48 h細胞大部分重合，表明這2 個時間點間給予相同劑量雷公藤甲素后，細胞代謝物差異較小。在SIMCA-P 13.0 軟件中構建PLS-DA 模型，得分圖見圖3B，模型參數R2X＝0.661，R2Y＝0.643，Q2＝0.427；置換檢驗結果見圖3C，Q2回歸直線的縱截距為-0.281，說明所建模型不存在過擬合現象，能較好地反映細胞代謝輪廓。在PLS-DA 得分圖上可以看出，不同時間點雷公藤甲素組和空白組的樣本區分明顯，干預12、24、48 h 時代表細胞的點在圖中呈現同向移動的變化趨勢，說明雷公藤甲素處理HepaRG 細胞12 h 后，細胞內源性代謝物已經產生顯著變化，而且隨時間延長而逐漸增大。

圖2 不同時間空白組和雷公藤甲素組的TIC 色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of the control groups and the triptolide groups at different time

圖3 各組HepaRG 細胞的代謝輪廓分析Fig.3 Analysis of metabolic profiles for HepaRG cells in each group

使用上述PLS-DA 模型計算HepaRG 細胞樣本中各變量的VIP 值，以VIP ＞1.0 和單因素方差分析P＜0.05 為條件鑒定差異代謝物。如表1 所示，共鑒定出26 個顯著性差異代謝物，包括氨基酸類、糖類、脂類等小分子物質；與空白組相比，雷公藤甲素處理HepaRG 細胞12 h 后大部分代謝物（如棕櫚油酸、蘋果酸、氨基丙二酸等）出現明顯改變，處理24、48 h 后部分代謝物（如泛酸、賴氨酸、絲氨酸等）水平降低。對上述代謝物數據歸一化后聚類分析，所得熱圖見圖4，各組細胞樣本中代謝物的相對水平和變化趨勢見圖5。

3.4 代謝通路分析 將上述鑒定得到的顯著性差異代謝物導入MetaboAnalyst 4.0 網站（http：／／www.metaboanalyst.ca／）中進行代謝通路分析，以影響值大于0.1 為條件，篩選得到11 條可能涉及的代謝通路，見圖6。圖中圓點越大的通路，對代謝通路的重要性越大。

4 討論

近年來隨著雷公藤甲素在臨床的廣泛應用，其不良反應受到重視，其中雷公藤甲素誘導肝毒性的機制復雜，仍有待進一步深入研究。本研究運用了基于GC-MS 的代謝組學技術，建立了具有區分度和預測性的PCA 和PLS-DA 模型，對不同時間點的空白組和雷公藤甲素組HepaRG 肝細胞進行區分及預測，篩選出26 個顯著性差異代謝物，涉及11條代謝通路。

4.1 雷公藤甲素通過影響氨基酸代謝通路擾亂肝細胞基本生命活動 氨基酸是生命活動的基本物質，肝臟是機體內進行氨基酸代謝的主要場所。在氨基酸代謝途徑中，肝臟損傷導致氨基酸代謝紊亂，肝細胞內的氨基酸合成減少。其中天冬氨酸在相關酶的催化作用下參與機體新陳代謝，緩解三羧酸循環中草酰乙酸、蘋果酸等中間產物的缺失，促進三羧酸循環的正常運行及ATP 的產生［6］，同時天冬氨酸在酶的作用下轉化為天冬酰胺，是機體合成脂肪酸的碳源之一。雷公藤甲素能明顯降低HepaRG 細胞中天冬氨酸水平，減少細胞能量供應，進一步加重肝損害。細胞可從甘氨酸合成絲氨酸，并且絲氨酸在細胞代謝中發揮重要作用，產生一碳單位，參與嘧啶與嘌呤合成、免疫球蛋白合成和脂肪酸代謝等，促進細胞的正常增殖與生長［7］，故絲氨酸水平下降時，可能從多個方面誘導肝細胞的損傷。氨基酸在氨基酰-tRNA 合成酶的催化下，與相對應的tRNA 精確結合生成氨基酰-tRNA，為蛋白質的生物合成提供必需原料［8］。雷公藤甲素減少細胞內氨基酸的合成時，氨基酰-tRNA 生物合成也受到影響，可直接抑制細胞營養物質蛋白質的生成，從而抑制細胞的生命活動。

表1 雷公藤甲素干預HepaRG 細胞的潛在生物標志物Tab.1 Potential biomarkers of triptolide intervention in HepaRG cells

圖4 生物標志物熱圖Fig.4 Biomarker heatmap

圖5 各組HepaRG 細胞代謝物的相對水平Fig.5 Relative levels of metabolites in HepaRG cells of each group

4.2 雷公藤甲素通過改變糖代謝通路干擾肝細胞能量代謝過程 檸檬酸循環又稱為三羧酸循環，既是三大營養物質（糖類、脂肪、蛋白質）代謝的共同最終通路，又是它們相互聯系的重要樞紐［9］，Chen 等［10］認為，雷公藤損傷細胞線粒體，阻礙了三羧酸循環，使其上游和下游的能量代謝不一致。本研究中鑒定出的三羧酸循環相關代謝物主要有蘋果酸和丙酮酸，雷公藤甲素干預后細胞中兩者含有量減少，低于空白組細胞。蘋果酸水平的減少致其脫氫后生成的進入下一循環的草酰乙酸減少，同時葡萄糖的分解也隨之降低；丙酮酸是三羧酸循環中重要的中間產物，在相關酶的作用下轉化為乙酰輔酶A 和草酰乙酸，從而參與能量代謝過程，雷公藤甲素可能通過影響中間代謝產物破壞三羧酸循環的穩定，對細胞產生了傷害。此外，煙酸可在機體內轉化為煙酰胺，后者作為輔酶NADH 和NADPH的重要前體，是三羧酸循環必不可少的電子轉運蛋白［11］。Wang 等［12］發現，雷公藤甲素的毒性作用改變機體泛酸代謝途徑，泛酸是三羧酸循環等途徑的中間產物之一，可在機體內轉化為輔酶A，后者是機體內多種酶的輔助因子。本實驗觀察到，煙酸和泛酸含有量降低也表明能量代謝受損。

圖6 雷公藤甲素干預HepaRG 細胞的代謝通路分析Fig.6 Analysis of metabolic pathway of HepaRG cells under triptolide intervention

4.3 雷公藤甲素通過干預脂類代謝通路加劇肝細胞氧化損傷 脂質在肝臟代謝中具有關鍵作用。Xie 等［13］發現，長期使用雷公藤會導致肝臟脂質穩態失衡，從而造成肝臟損傷。本實驗結果顯示，雷公藤甲素干預后不飽和脂肪酸（如棕櫚油酸等）水平顯著下降，可能是由于肝細胞受損時在氧化應激過程中產生活性氧（ROS），后者促使肝細胞膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，使其水平減少。丁酸是短鏈脂肪酸的一種，丁酸鈉（NaBu）是其鈉鹽，能改善細胞的氧化應激狀態，抑制炎性因子表達［14-15］，雷公藤甲素改變細胞內丁酸代謝，影響NaBu 對機體氧化損傷的保護作用，從而加劇肝臟損傷。肌醇能被磷酸化生成磷脂酰肌醇，細胞中后者在相應酶的作用下生成多種衍生物，直接參與多種細胞活動過程，包括膜泡運輸、離子轉運、信號轉導、細胞凋亡等，雷公藤甲素對細胞造成損傷后可破壞磷脂代謝途徑，妨礙細胞活動。

綜上所述，本研究初步探討了雷公藤甲素對肝細胞HepaRG 的毒性作用機制，通過代謝組學技術揭示該成分引起肝細胞毒性的主要因素可能與氨基酸代謝、糖代謝和脂類代謝相關，可為其在臨床上安全有效的應用提供參考。