基于網絡藥理學探討射干-麻黃治療哮喘的機制

黃秀芳，劉城鑫，黃慧婷，徐衛方，劉 瓊，劉小虹?

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518000）

哮喘是世界上最常見的慢性呼吸道疾病，隨著吸煙和過敏率的增加，以及空氣污染和人口老齡化，其發病率逐年上升，在1%～21% 之間［1］，除了常見的臨床表現（如喘息、呼吸短促、胸悶和咳嗽等）外，還可引起呼吸衰竭、心血管疾病、腎臟疾病、猝死等并發癥，不僅危害人類健康，還增加經濟負擔。其發病機制復雜［2］，現公認的包括慢性氣道炎癥、氣道高反應性、可逆性氣道限制、氣道免疫炎癥和神經調節導致的氣道重塑［3］。臨床常用藥物有支氣管擴張劑和吸入性皮質類固醇，然而其副作用和患者耐受性使長期治療受到限制［4］，因此，開發天然的中草藥可為相關研究提供新的思考方向。

射干-麻黃來自《金匱要略》 中的射干麻黃湯，射干味苦，性寒，具有止咳化痰的功效；麻黃性溫，味辛、微苦，有宣肺平喘的功效，兩者配伍，共同發揮宣肺平喘、止咳化痰作用。現代藥理研究表明，射干具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、雌性激素樣等作用［5］，而麻黃則具有松弛支氣管平滑肌、免疫抑制、抗氧化、鎮咳平喘等作用，配伍后治療哮喘的前景廣闊［6］。劉小虹教授從事肺系疾病治療30 余年，對哮喘有獨特的醫治心得，本研究收集她于廣州中醫藥大學第一附屬醫院嶺南名醫診區坐診時的哮喘病歷資料，以古今醫案云平臺（V1.5.7）分析使用頻次最高的藥對，并對其機制進行初步研究。

1 資料與方法

1.1 處方來源 收集2017 年12 月至2019 年1 月劉小虹教授于廣州中醫藥大學第一附屬醫院嶺南名醫診區坐診時的病歷資料，均涉及支氣管哮喘。

1.2 處方納入與排除標準 納入標準①診斷符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘醫學組制定的《支氣管哮喘防治指南（2016 版）》，并排除其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽；②病歷記載詳細、完整、準確，包括患者年齡、診次、病史、癥狀、診斷、方藥等；③有不少于1 次的復診記錄，并且治療后患者主觀癥狀或客觀指標改善。排除標準①不符合支氣管哮喘診斷標準，或確診引起肺功能改變的其他疾病，如慢阻肺、肺結核、急性呼吸窘迫綜合征、肺炎等，以及近期有手術、外傷等影響呼吸功能的；②病案中關鍵信息（如主訴、現病史、刻下癥、證候診斷、方藥等）記錄不完整；③2 次就診記錄之間，在其他醫院門診已開具處方治療；④合并其他心、腦、腎等危重疾病。

1.3 數據規范化與錄入 60 首門診處方參照《中藥學》［7］規范統一藥物名稱，如蛤殼＝海蛤殼、甘草片＝甘草、姜厚樸＝厚樸、甘草泡地龍＝地龍、冬瓜子＝冬瓜仁等。由2 位研究者分別將門診病歷錄入Microsoft Excel 中，經第3 位研究者進行審核，并按照標準進行規范化處理，最后統一導入古今醫案云平臺中，對數據進行分析挖掘。

1.4 數據統計與分析 導入古今醫案云平臺后，執行數據標準化選項，并將結果批量加入分析池，執行藥頻統計、用藥規律分析等功能。

1.5 射干-麻黃活性組分與對應靶點的篩選 射干-麻黃的活性化合物來源于TCMSP（http：／／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php），含有大量中草藥的化學成分和藥物的動力學特性信息。其中，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）代表藥物散布于體循環的效率，類藥性（drug-likeness，DL）則代表優化的藥代動力學和藥物性質。本研究選擇OB≥30%、DL≥0.18，并結合已報道的麻黃與射干中含有量較高的活性成分，得出射干-麻黃藥對有效化合物［5，8］，并借助TCMSP 篩選出相關靶點，輸入UniProt 數據庫，限定物種為“human”，獲得蛋白靶點的對應的基因信息，將化合物-靶點的數據集導入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化。

1.6 與哮喘有關的靶點篩選 哮喘有關靶點的數據來自2 個數據庫：（1）Drugbank 數據庫（https：／／www.drugbank.ca／），可獲取與哮喘相關的靶點［9］；（2）TTD（http：／／systemsdock.unit.osit.jp／iddp／home／index），包含有關治療性蛋白質的基因靶點、相關疾病、途徑和相應藥物。從中獲得與哮喘相關的靶點，輸入UniProt 數據庫，限定物種為“human”，獲得蛋白靶點的對應的基因信息，將哮喘-靶點的數據集導入Cytoscape 3.7.1 軟件進行可視化［9］。

1.7 核心靶點的篩選與蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建 將射干-麻黃藥對的靶點和與哮喘有關的靶點上傳至在線Draw Venn Diagram（bioinformatics.psb.ugent.be／Webtools／Venn／），

得到兩者的交集核心靶點，輸入String 11.0 數據庫（https：／／string-db.org／），得到互作關系，以Combined score＞0.4 為篩查標準［10］。

1.8 核心靶點的GO 分析 Metascape 可幫助生物醫學研究界分析基因／蛋白質列表，作出更好的數據驅動決策。將核心靶點輸入Metascape 進行GO分析，即可獲得核心靶點的GO 信息，參數設置為H species（1）［11］。

1.9 核心靶點的KEGG 通過David 6.8 數據庫（https：／／david.ncifcrf.gov／home.jsp）對核心靶點 行 KEGG 通路分析，參數設置為“ homo sapiens”，限定只展示P＜0.05 的KEGG 結果［12］。

2 結果

2.1 治療哮喘藥物頻次統計 共錄入60 首門診處方，核心藥物是射干、麻黃、紫蘇葉、浙貝母、杏仁、甘草、防風、款冬花、法半夏、紫蘇子、紫菀等，其中射干、麻黃出現頻次最高，均為60 次，說明兩者在治療哮喘中具有重要意義。見圖1。

圖1 治療哮喘核心藥物頻次Fig.1 Frequency of core drugs for asthmatic treatment

2.2 核心藥物關聯規則 采用Apriori 算法，支持度越高時，越能體現其核心規律。置信度表示當“-＞”左邊的藥物出現時，“-＞”右邊藥物出現的概率，其中射干、麻黃支持度、置信度均為1，表示處方中出現其中一者時，另一者出現的可能性是100%。其他藥物見表1。

2.3 治療哮喘藥物頻次統計 通過TCMSP 篩選得出射干-麻黃有效化合物共有42 個，18 個來自射干，24 個來自麻黃，將其合并后刪除重復項，剩余40 個，見表2。

2.4 射干-麻黃-靶點相互作用網絡 射干-麻黃靶點網絡共包括762 個節點，包括40 個化合物節點、722 個靶點節點，并含有1 524 條互相作用的邊，表示所含化合物與相互作用之間的關系；節點的度值表示邊或目標的數量，度值越高的化合物或靶點，在網絡中可能是越關鍵的樞紐。射干-麻黃存在1 個化合物與多個靶點的互相作用，也存在不同化合物作用于同1 個靶點，本研究確定了9 個節點度值≥22 度的化合物、6 個節點度值≥10 度的靶點。具體而言，槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚、環鳶尾醛型三萜、柚皮素、β-谷甾醇、麻黃堿分別作用于146、112、62、58、36、36、36、24個靶點，可能是射干-麻黃重要的生物活性成分；PTGS2、PTGS1、HSP90AB1、NCOA2、AR、PIK3CG 分別與30、26、24、19、12、11 個化合物間有聯系，可能是其發揮藥性的重要基礎。見圖2。

表1 治療哮喘核心藥物間置信度Tab.1 Contradictions between core drugs for asthmatic treatment

表2 射干-麻黃中40 個有效化合物Tab.2 Forty effective compounds in Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba

圖2 射干-麻黃-靶點網絡圖Fig.2 Network diagram for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba

2.5 哮喘-靶點相互作用網絡 通過Drugbank、TTD數據庫得出與哮喘相關的88 個作用靶點，導入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化，與哮喘相關的包括NPSR1、CYSLTR1、MYLK、ADORA2A、ADORA2B、ADRA2C、ALOX5、SERPINC1、NPR1、ADRB2、BDKRB2 等。見圖3。

圖3 哮喘-靶點網絡圖Fig.3 Target network diagram for asthma-targets

2.6 射干-麻黃與哮喘的核心靶點的構建 通過TCMSP 數據庫得出射干-麻黃有效化合物對應的靶點，刪除重復的后共有256 個，通過Drugbank、TTD 數據庫獲得與哮喘相關的基因88 個，在線軟件進行交集分析后發現15 個，包括PTGER3、CHRM4、ADRA2C、SERPINE1、NOS2、ALOX5、PTGS2、ERBB2、IL-4、PDE3A、ADRB2、CCL2、CHRM2、CHRNA7、OPRM1，見圖4。將射干-麻黃與哮喘核心靶點導入String 11.0 進行分析，其中節點表示靶點蛋白，邊則代表靶點蛋白與靶點蛋白相互作用的關系，PPI 提示該網絡含有15 個節點、33 條邊，節點度的平均值為4.4，見圖5。

圖4 射干-麻黃-靶點與哮喘-靶點的韋恩圖Fig.4 Venn diagram for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba-target and asthma-target

圖5 射干-麻黃與哮喘核心靶點的PPI 網絡圖Fig.5 PPI network diagram for core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

2.7 射干-麻黃與哮喘核心靶點的GO 分析 圖6提示，射干-麻黃與哮喘核心靶點主要涉及的生物學功能包括白細胞介素-4 和白細胞介素-13 信號傳導、G 蛋白偶聯受體信號通路，以及環核苷酸第二信使偶聯、鈣信號通路、平滑肌收縮、信號受體活性的調節、cAMP 介導的信號傳導、發熱、對脂多糖的反應、調節內皮細胞凋亡過程、蛋白激酶活性的正調節、血管生成、癌癥的途徑等。

圖6 射干-麻黃與哮喘核心靶點的GO 分析Fig.6 GO analysis of core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

2.8 射干-麻黃與哮喘核心靶點的KEGG 分析 表3 提示，射干-麻黃藥對與哮喘核心靶點主要涉及的通路包括鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用、調節脂肪細胞中的脂肪分解、cAMP 信號通路、HIF-1 信號通路、膽堿能突觸、癌癥的途徑、cGMP-PKG 信號通路。

3 討論

哮喘是一種常見的復雜呼吸系統疾病，中藥不僅控制其癥狀，還可提高患者日常生活質量，減少急性發作的次數［9］。射干-麻黃來源于《金匱要略》，其中射干具有抗炎、鎮痛、祛痰、平喘、抑菌、抗病毒、抗腫瘤的作用，以及雌性激素樣與增強體液免疫活性，臨床主要用于治療支氣管哮喘，支氣管炎，慢性阻塞性肺疾病等肺系疾病［13-14］；麻黃主要具有解熱發汗、鎮咳平喘、利尿、免疫抗炎、抗菌、抗病原微生物、鎮痛、抗腫瘤等作用，臨床主要用于治療感冒、支氣管哮喘、腎炎等［5，15］。本研究通過收集劉小虹教授治療哮喘的驗案，并使用古今醫案云平臺進行數據挖掘，進一步證明了射干-麻黃是治療哮喘的常用藥對。

射干-麻黃藥對具有40 個有效化合物，作用于722 個靶點節點，其中作用最強的前8 個包括槲皮素、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、β-谷甾醇、麻黃堿等。槲皮素可明顯減輕大鼠哮喘癥狀和IL-5、IL-6 水平，并能降低血中嗜酸粒細胞及IgE 水平，升高IFN-γ 水平，還可下調哮喘模型鼠氣道上皮TLR4／NF-κB 表達，減輕氣道炎癥［16-18］；木犀草素可能通過調控PPARγ 表達和p38MAPK 信號通路而抑制哮喘大鼠氣道炎癥，從而起到抑制平滑肌重塑的作用，還可降低哮喘模型大鼠血清中IL-4 水平，升高IFN-γ 水平［19-20］；豆甾醇可減少哮喘模型豚鼠細支氣管周圍、血管周圍和肺泡炎性細胞的浸潤，并可逆轉膠原沉積［21］；柚皮素可緩解哮喘模型小鼠氣道的慢性炎癥，還可降低支氣管肺泡灌洗液中Th2 水平和血清中IgE 水平，同時延緩氣道重塑的進展［22］；β-谷甾醇抑制哮喘模型豚鼠TNFα、IL-4、IL-5 水平，可預防肺組織組織病理學中的氣道炎癥，抑制Th2 細胞因子的釋放／合成［23］；麻黃堿具有松弛支氣管平滑肌、抗氧化、抗病毒、抗癌、鎮咳平喘的作用，還可降低iNOS 水平，減輕 哮喘模型小鼠的癥狀［6，24］；化合物-靶點中PTGS2、PTGS1 即是COX2、COX1，山柰酚可通過抑制COX2 介導的致敏肥大細胞中前列腺素D2 產生來抑制哮喘小鼠的氣道壁增厚［25］。氟替卡松、布地奈德和曲安西龍均可顯著降低COX2 與COX1表達，從而起到治療哮喘的作用［26］。HSP90AB1參與調節蛋白結構和特定靶蛋白，涉及細胞周期控制和信號轉導和調節與ATP 酶活性相關的功能循環，與腫瘤的發生發展具有密切的關系［27］。AR 缺陷的肺泡巨噬細胞，會導致嗜酸性粒細胞募集趨化因子和IL-5 減少，揭示它促進M2 巨噬細胞極化的新穎作用［28］。NCOA2 與PIK3CG 均與脂質代謝相關，其中NCOA2 還與腫瘤增殖、轉移和侵襲相關［29-31］。射干與麻黃均具有抗腫瘤的作用，GO、KEGG 分析都提示兩者具有調節脂質代謝和能量代謝的功能，這可能是它們發揮抗腫瘤、調節脂質、熱量代謝的潛在物質基礎。射干-麻黃治療哮喘是多途徑的協同增效作用，如調節炎性因子NOS2、PTGS2、IL-4；PTGER3 是前列腺素E2 鑒定的4 種受體之一，其基因多態性在阿司匹林哮喘的發病機制中起重要作用［32］。SERPINE1 是一種糖蛋白，可促進氣道纖維化，可能在慢性哮喘氣道炎癥的背景下導致氣道阻塞［33］。研究表明，ALOX5 與基因多態性之間存在遺傳關聯，可以作為阿司匹林哮喘治療反應的診斷標志物或預測因子［34］。上皮生長因子（EGF）家族成員在上皮細胞分化，增殖和修復中起重要作用，據報道哮喘患者中ERBB2 表達較低，限制了上皮修復過程，故恢復其穩態功能應被視為新的哮喘治療靶點［35］。異丁司特在日本被廣泛用于治療哮喘，其作用方式是通過抑制環核苷酸磷酸二酯酶（PDEs），但其優先抑制PDE3A，可能成為治療哮喘的新途徑［36］。ADRB2 基因中的Glu27 變體與哮喘急性發作的頻率增加相關，CHRM2 多態性與哮喘的遺傳病因學有關，CCL2 哮喘介導趨化性，在哮喘模型鼠中的水平明顯增高［37-39］，這說明所得核心靶點大部分與哮喘發生有關，可能是射干-麻黃發揮治療哮喘的潛在靶點。

表3 射干-麻黃與哮喘核心靶點的KEGG 分析Tab.3 KEGG analysis of core targets for Belamcandae Rhizoma-Ephedrae Herba and asthma

從GO、KEGG 富集分析可知，核心靶點主要富集于白細胞介素-4 和白細胞介素-13 信號傳導、鈣信號通路、平滑肌收縮、cAMP 介導的信號傳導、對脂多糖的反應、蛋白激酶活性的正調節、癌癥的途徑、HIF-1 信號通路、膽堿能突觸、cGMPPKG 信號通路等，其中與哮喘最相關的包括鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用、cAMP 信號通路、HIF-1 信號通路、白細胞介素-4 和白細胞介素-13 信號信號傳導、膽堿能突觸、cGMP-PKG；調節熱量或脂質代謝有可能是射干-麻黃潛在的藥理作用，對心血管系統有一定的干預作用，而涉及的癌癥途徑更是證明了兩者具有抗腫瘤活性，與先前研究一致，也印證了網絡藥理學的準確性。