HPLC 法同時測定白術中4 種倍半萜

丁逸雪，徐繼校，吳 威，陸潔淼，董詩慧，余佳琰，秦路平，朱 波

（浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053）

白術系菊科蒼術屬植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，別名桴薊、于術、楊桴、吳術、片術等，為多年生草本植物，以根莖入藥，是浙江省著名道地藥材“浙八味”之一［1-2］。白術主要分布在浙江、安徽、河南等省，性溫，味辛、苦，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，臨床多用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、胎動不安，被譽為健脾補氣第一要藥［3-4］。倍半萜類是白術的主要有效成分，包括白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮等，現代藥理學研究表明白術倍半萜類成分具有抗炎［5-6］、利尿［7］、抗衰老［8］、抗病毒［9］、抗腫瘤［10］、促進胃腸運動［11］、提高機體免疫力［12］等作用。

白術現有報道多集中在藥理藥效［13］、提取工藝［14］、栽培技術［15］、化學成分［16］等方面，已有的含有量測定報道也多側重于方法學考察與不同批次飲片研究［17-18］。白術藥材原植物分布經緯度跨度大，不同生境因子下藥材質量參差不齊，加上白術現有栽培技術與栽培品系繁多混雜，導致偽品沖擊、以次充好等現象頻發，阻礙了白術產業可持續發展。不同產地來源的白術中次生代謝產物成分含有量存在差異，影響著中成藥的質量和用藥安全［19］。因此，課題組以白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮4 種倍半萜類成分為指標性狀，收集全國白術主產區7 個產地白術種質資源，建立HPLC 法對其進行含有量測定，并分析白術生長性狀、產地生境因子與倍半萜類成分含有量之間的相關性，以期為白術藥材質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥材 2017 年10 月至2017 年11 月，收集浙江於潛、浙江慶元、安徽亳州、浙江東陽、河南溫縣、浙江磐安、浙江新昌等7 個產地新鮮白術種質資源，經浙江中醫藥大學生藥學教研室張巧艷教授鑒定為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 儀器與試劑 600-2998 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；FA2004 型電子分析天平（上海恒平精密電子儀器有限公司）；KQ-300DV 型超聲波（上海穎漢科技有限公司）；DXF-60D 型中藥打粉機（廣州市大祥電子機械設備有限公司）；DHG-9031A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信試驗儀器有限公司）。白術內酯Ⅰ（B20054）、白術內酯Ⅱ（B20055）、白術內酯Ⅲ（B20056）、蒼術酮（B20129）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司。色譜純乙腈、甲醇均購于北京京科瑞達科技有限公司；分析純甲醇購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長性狀測定 取健康白術塊莖，蒸餾水洗凈，陰干，用直尺測量塊莖縱徑、橫徑，計算縱橫徑比＝縱徑／橫徑，摘除塊莖須根，用電子天平稱定塊莖鮮重（n＝15）。

1.3.2 含有量測定

1.3.2.1 色譜條件 Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，50%～70% A；31～45 min，78%～95%A；46～50 min，50%A）；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長220、276 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1.3.2.2 線性關系考察 精密稱取適量白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮對照品，用甲醇制備成終質量濃度分別為0.13、0.25、0.015、2.0 mg／mL 的對照品溶液。分別精密吸取白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ對照品溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、2.0 mL，甲醇定容至5 mL；分別精密吸取白術內酯Ⅲ對照品溶液0.30、0.60、1.2、2.4、4.8、9.6 mL，甲醇定容至50 mL；分別精密吸取蒼術酮對照品溶液0.30、0.60、0.90、1.2、1.5、1.8 mL，甲醇定容至2 mL，吸取上述溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“1.3.2.1”項色譜條件下依次進樣，4 種成分檢測波長分別為220、220、220、276 nm。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

1.3.2.3 供試品溶液制備 將洗凈后的塊莖切片，置于60 ℃烘箱中烘至恒定質量，粉碎后過3 號篩。精密稱取白術塊莖樣品粉末0.5 g，20 mL 甲醇超聲提取30 min，抽濾，濾液用甲醇定容至25 mL 量瓶中，避光密閉保存。取適量樣品溶液，過0.45 μm微孔有機濾膜，取續濾液，即得。

1.3.2.4 精密度試驗 取白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮對照品溶液適量，在“1.3.2.1”項色譜條件下依次進樣6 次，測得白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮峰面積RSD 分別為1.01%、0.83%、1.19%、0.92%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.5 穩定性試驗 取浙江慶元樣品，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h 在“1.3.2.1”項色譜條件下進樣，測得白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮峰面積RSD 分別為0.89%、1.42%、1.48%、1.94%，表明供試品溶液在避光密閉保存24 h 內穩定性良好。

1.3.2.6 重復性試驗 取浙江慶元樣品3 份，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.3.2.1”項色譜條件下進樣，測得白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮含有量RSD 分別為2.49%、2.03%、1.04%、1.96%，表明該方法重復性良好。

1.3.2.7 加樣回收率試驗 取含有量已知的浙江慶元樣品，精密稱定0.2 g，加入白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮對照品適量，按“1.3.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.3.2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

1.4 數據處理與分析 應用DPS 9.5、SPSS 24.0軟件處理數據。方差分析采用單因素ANOVA 分析，聚類分析采用類平均法（UPGMA）［20］。

2 結果與分析

2.1 生長性狀比較 不同產地白術塊莖生長性狀存在差異（P＜0.05 或P＜0.01）。供試白術塊莖平均縱徑、橫徑、鮮重分別為12.28 cm、6.41 cm、80.22 g，其中安徽亳州產者較大，縱徑、橫徑、鮮重分別為15.94 cm、8.04 cm、98.30 g；河南溫縣產者相對較小，縱徑、橫徑、鮮重指標僅分別為9.03 cm、4.56 cm、64.98 g；浙江東陽產者較為瘦長，縱橫徑比為2.14，而浙江新昌產者較為寬胖，縱橫徑比僅為1.72。見表4。

表4 不同產地間白術生長性狀、4 種倍半萜含有量比較（±s，n＝3、15）Tab.4 Comparison of growth traits and four sesquiterpenes contents in A.macrocephala from different growing areas（±s，n＝3，15）

表4 不同產地間白術生長性狀、4 種倍半萜含有量比較（±s，n＝3、15）Tab.4 Comparison of growth traits and four sesquiterpenes contents in A.macrocephala from different growing areas（±s，n＝3，15）

注：n＝3，表示4 種成分含有量數據為3 次生物學重復；n＝15，表示縱徑、橫徑、縱橫徑比、鮮重數據為15 次生物學重復。7 個產地組間比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

2.2 倍半萜類含有量比較 7 個產地間白術塊莖中4 種倍半萜含有量存在統計學差異（P＜0.01），白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮平均含有量分別為1.18、1.75、0.044 1、68.11 mg／g。其中，浙江於潛產者白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮含有量最高，浙江慶元產者白術內酯Ⅱ含有量最高，安徽亳州產者白術內酯Ⅰ、蒼術酮含有量最低，河南溫縣產者白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ含有量最低。

2.3 相關性分析 表5 顯示，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、蒼術酮含有量與塊莖縱徑、橫徑、鮮重、緯度呈負相關關系，其中蒼術酮含有量與緯度負相關系數最高（-0.651 3），與塊莖縱橫徑比、經度、海拔、降雨量、年平均溫度呈正相關關系，其中蒼術酮含有量與海拔正相關系數最高（0.820 2）；白術內酯Ⅲ含有量與縱橫徑比、緯度呈負相關關系，與塊莖縱徑、橫徑、鮮重、經度、海拔、降雨量、年平均溫度呈正相關關系，其中與塊莖縱徑正相關系數最高（0.530 3）。

表5 白術4 種倍半萜含有量與生長性狀、生境因子相關性分析Tab.5 Correlation analysis of sesquiterpenes contents，growth traits and geographical factors

2.4 聚類分析 以白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮含有量和生長性狀為參考指標，對7 個產地白術進行聚類分析，根據歐氏距離D2＝16.08 將不同產地劃分為3 個類群，見圖2。類群Ⅰ共5 個產地，均為浙產白術，分別為浙江磐安、浙江新昌、浙江於潛、浙江東陽、浙江慶元，該類群塊莖較瘦長，中等大小，倍半萜含有量較高；類群Ⅱ、Ⅲ各有1 個產地，為非浙產白術，分別為河南溫縣與安徽亳州，前者產塊莖較小，后者產塊莖較大而寬胖，兩者倍半萜含有量均較低。

3 討論與結論

圖2 7 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of seven batches of samples

本實驗顯示，白術內酯Ⅰ的最大檢測波長為276 nm，白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ與蒼術酮的最大檢測波長為220 nm，所以確定檢測波長為220、276 nm；考察了流動相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸）、提取方法（超聲、索式提取、加熱回流）、提取時間（20、30、40 min）對白術倍半萜成分含有量的影響，發現4 種成分在甲醇中超聲處理（2 509 W，33 kHz）30 min 即可提取完全，以乙腈-水為流動相洗脫效果較好，各峰之間的分離度＞1.5，理論塔板數＞3 000，白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ、蒼術酮保留時間分別為24.238、17.644、25.014、41.202 min，定量限分別為1.84、2.32、0.037、10.96 μg／mL，檢測限分別為0.76、1.07、0.021、10.96 μg／mL。

藥用植物生長發育情況及環境條件對次生代謝產物積累都具有重要的影響，包括生長性狀、經緯度、海拔、降雨量等［21］。本實驗顯示，7 個產地白術塊莖中4 種倍半萜含有量存在統計學差異（P＜0.01），其中浙江產高于安徽、河南產；海拔、年平均溫度與白術內酯Ⅰ、蒼術酮含有量呈正相關，而且相關性系數較大。課題組發現，浙江於潛的海拔為377 m，遠低于浙江磐安的661 m，但前者產樣品中白術內酯Ⅰ蒼術酮的含有量卻高于后者產，可能是由于前者海拔過高，導致年平均溫度低于后者，影響了倍半萜在白術塊莖中的積累，也表明於潛特定的生境因子可能是當地品種品質較好的原因之一。高經度、低緯度、高海拔的環境有利于白術倍半萜類成分積累，故可優先在擁有上述地域條件的浙江種質中選擇。對于安徽、河南產地白術，本實驗分別只收集到了1 個樣本，代表性較弱，下一步將繼續進行安徽、河南、湖南等非浙江產地的資源收集與含有量測定。