巴戟天不同部位中6 種寡糖分布規律

楊 麗，孫 恬，馮 沖，蔡苗苗，丁 平?

［1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.天方健（中國） 藥業有限公司，廣東 廣州 510623］

巴戟天Morinda officinalisHow 為茜草科藤本植物，是我國嶺南地區（尤其是廣東、廣西）最受歡迎的中藥材之一，主要用于骨骼保護、男科和婦科保健方面［1］，含有多種成分，其中以蒽醌、環烯醚萜苷類等次生代謝產物和糖類較多［2-3］。菊淀粉型寡糖作為一類生理活性物質，具有促進精子生成、抗抑郁、調節激素水平等作用，在疾病預防、治療、營養保健等方面有著極大的應用潛力［4-6］。在2015 年版《中國藥典》 一部中，以巴戟天所含耐斯糖含有量來衡量藥材質量，規定干品中其含有量不得少于2.0%［7］。

中藥材的外觀性狀特性是評價其質量的重要指標，市場上常根據藥材的直徑、長度等性狀將其劃分成不同的等級規格，如黃芩、天麻、黃芪等［8-9］，巴戟天的等級亦是根據直徑大小來劃分，直徑越大，等級越高，價格就越高。但現在巴戟天野生資源匱乏，市場需求量較大，存在部分種植戶使用激素或過度施肥來提高產量，縮短種植年限，導致其根條粗壯、肉質肥厚而有效成分含有量卻很低，藥材質量明顯下降，對臨床用藥安全造成了一定的隱患。因此，僅根據直徑劃分等級能否真正區分巴戟天藥材質量、這種劃分方式是否科學還有待進一步研究，另外，藥材其他部位是否有寡糖分布尚未有文獻報道。所以，本研究通過探索巴戟天根系及其他部位寡糖類成分的分布規律，以期為建立科學合理的藥材商品規格和資源的有效利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Primaide 高效液相色譜儀（日立高新技術公司）；ELSD-UM5800 蒸發光散射檢測器（上海通微有限公司）；XR205 SM-DR 電子分析天平（0.01 mg，瑞士Precisa 公司）；電子分析天平（0.1 mg，德國Sartorius 公司）；CQ-200 超聲波清洗器（上海音波聲電科技公司）；LD4-2A 低速離心機（北京醫用離心機廠）。

1.2 試劑與藥物 色譜純乙腈（美國ACS 公司）；色譜純三乙胺（天津科密歐化學試劑有限公司）；分析純無水乙醇（天津市百世化工有限公司）；水為去離子水。

果糖（批號SS0905GA14）、葡萄糖（批號SA0418GA14）、蔗糖（批號S02S6G1）蔗果三糖（批號AWG0714）、耐斯糖（批號Z17A9H59088）、蔗果五糖（批號S09A8D41431）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司（純度均大于98%）。

在廣東德慶縣高良鎮巴戟天種植基地收集同一年限巴戟天（均為4 年生），經廣州中醫藥大學丁平研究員鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalisHow 全株，分為主根、側根、須根、木心、根莖、莖、葉7 個部位。為了解巴戟天根中耐斯糖等寡糖的分布規律，再將主根和側根分為根頭、根中、根尖3 個部分，并測量每個分段的上下橫截面直徑，取平均值。共取10 株樣品，除去木心，打碎（過2 號篩），測定寡糖類成分、水分含有量（按干燥品計算）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridgeTMAmide 色譜柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流動相0.2%三乙胺乙腈（A）-0.2%三乙胺水（B），梯度洗脫，程序見表1；柱溫35 ℃；進樣量20 μL；ELSD 漂移管溫度75 ℃；氮氣體積流量2.5 L／min［10］。空白溶液、對照品及供試品色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖對照品適量，60%乙腈溶解后定容至10 mL，制成質量濃度分別為0.750、1.061、1.210、0.832、1.280、1.658 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 稱取1.0 g 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定質量，靜置30 min，超聲處理（250 W、80 kHz）20 min，50%乙醇補足減失的質量，3 000 r／min 離心10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，50% 乙醇定容至1 mL，制成不同質量濃度的溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量的對數為橫坐標（X），峰面積積分值的對數為縱坐標（Y）進行回歸。結果見表2。

2.3.2 精密度試驗 吸取同一供試品溶液（主根根頭），在“2.1”項色譜條件下連續進樣6 次，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為1.91%、4.73%、1.57%、2.86%、2.15%、1.94%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 重復性試驗 取同一批巴戟天（主根根頭）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為 2.20%、2.68%、4.12%、3.26%、2.10%、2.01%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取巴戟天（主根根頭），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下于0、2.5、5、7.5、10、12.5、24、48、72 h 各進樣20 μL，測得果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量RSD 分別為1.77%、3.51%、3.51%、4.72%、5.09%、4.16%，表明供試品溶液在72 h 內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的巴戟天（主根根頭）9 份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入一定量對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，計算回收率。結果，果糖、葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖平均加樣回收率分別為97.28%、97.90%、101.00%、101.69%、99.79%、101.29%，RSD 分別為2.25%、2.08%、2.01%、1.92%、2.36%、1.78%。

2.4 樣品含有量測定 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共測定10 株巴戟天主根、側根、須根等7 個部位中耐斯糖等6 種寡糖含有量，每株至少對3 條主根和3 條側根進行分段測定，結果見表3。巴戟天主根和側根中均含耐斯糖等6 種寡糖類成分，主根中均大于側根中；10 株巴戟天主根和側根的根頭、根中、根尖中耐斯糖平均含有量分別為45.76、59.31、65.04 mg／g，直徑分別為0.92、0.77、0.67 cm。為考察根中6 種寡糖含有量與直徑是否具有相關性，利用SPSS 20.0 軟件對兩者進行相關性分析，結果見表4，表明耐斯糖、蔗果三糖、蔗果五糖含有量與對應分段樣品的直徑呈負相關。

表3 各成分含有量測定結果（±s，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（±s，mg／g）

表3 各成分含有量測定結果（±s，mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（±s，mg／g）

注：—為未檢測出。

表4 各成分含有量及直徑之間相關系數Tab.4 Correlation coefficients between various constituents’ contents and diameters

巴戟天其他部位須根和木心中所含寡糖類成分與主、側根一致，其中耐斯糖含有量分別為32.33、20.35 mg／g；根莖、莖和葉中僅含有果糖、葡萄糖或蔗糖，不含耐斯糖等4 鏈以上的寡糖。

3 討論

本實驗考察了影響巴戟天寡糖類成分提取效率的幾個因素，如提取方法（水浴、回流、超聲）、提取溶劑（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇）和提取時間（20、30、40 min）。結果，超聲提取率最高，故選擇超聲提取；50%甲醇、50%乙醇提取率均較高，但后者提取的寡糖成分色譜信息更豐富，分離度更好，同時甲醇毒性較大，因此選擇50%乙醇作為提取溶劑，提取時間以30 min 為宜。

本實驗在前期研究的基礎上，考察了甲醇-水、乙腈-水、三乙胺乙腈-三乙胺水對巴戟天寡糖的分離效果，發現采用甲醇-水為流動相時巴戟天寡糖分離效果并不理想；乙腈-水分離效果明顯改善，但基線漂移明顯，加入等比例三乙胺后能明顯改善，以2%～3%為最佳。考慮到3%三乙胺pH 值較大，可能會影響氨基柱使用壽命，因此選擇在流動相中添加2%三乙胺。

巴戟天根（主、側）中寡糖類成分分布具有明顯的規律，從根頭到根中、根尖，蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量逐漸增加，其中耐斯糖在根尖中高于根頭中約42%，在其他藥用植物中也具有類似規律［11-13］。結合相關報道［14］，推測可能是由根尖生長素含有量較高的因素造成，具體有待進一步研究。

巴戟天根中蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖含有量與其直徑呈負相關，與傳統的商品規格分級相矛盾［15］，課題組認為對該藥材進行規格劃分時，需將產地、生長年限、根直徑、寡糖成分分布規律等因素進行綜合考慮，基于前期研究［16-17］建議將4～5 年生巴戟天的根尖劃分為一等品，根中和根頭劃分為二等品或三等品。另外，其他部位須根和木心中所含寡糖類成分和主側根一致，其中耐斯糖含有量均較高，可考慮將兩者作為寡糖類成分提取的原料，有利于資源的有效利用。

本實驗首次對同一生長年限巴戟天不同部位中寡糖類成分的分布規律進行研究，以期為藥材等級標準的建立提供依據，同時也可為該資源的合理利用提供參考。