姜黃素聯合5-氟尿嘧啶對結腸癌SW620 細胞體外抑制的影響

張閏哲徐 露姚慶華?

（1.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.中國科學院大學附屬腫瘤醫院中西醫結合科，浙江省中西醫結合腫瘤重點實驗室，浙江 杭州 310022）

結腸癌是指結腸黏膜上皮或腺體在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生的惡性病變，是常見的惡性腫瘤之一。結腸癌是全世界第三大常見癌癥，全球新病例接近120 萬，死亡病例發生約60.8 萬，占所有癌癥死亡人數的8%，是造成癌癥死亡的第四大常見原因［1］。

目前，化療是結腸癌患者治療有效的手段，5-FU 類藥物是治療進展期最主要的藥物，然而其化療耐藥是導致患者化療失敗的重要原因，在進展期治療中只有10%～15%的效果［2］。因其機制復雜，目前尚未得到有效解決。

隨著近年中草藥的發展，天然植物或者礦物中藥提取的單體有效成分已經成為全球研究的熱點［3］。中藥成分姜黃素是中藥姜黃提取的多酚類化合物，具有抗氧化、抗耐藥、抗炎、抗病毒和抗凝作用，尤其它的抗腫瘤作用可以增加化療藥物敏感性，且有普遍研究意義［4-8］。本研究旨在探究姜黃素聯合5-FU 應用于結腸癌SW620 細胞，觀察姜黃素與5-FU 聯合用藥對SW620 細胞生長抑制是否具有協同作用，并初步闡明其機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 姜黃素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號C140600，純度≥65%）；5-FU（美國Selleck 公司，貨號s1209，純度99.97%）；四甲基偶氮哇藍（MTT，美國Sigma 公司，貨號3580GR001）；DMSO（美國Sigma公司，批號67-68-5）；1640 培養基（美國Gibico 公司，批號8118241）；DMEM 培養基（批號2017062901）、胰蛋白酶消化液（批號2017062802）購于杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；Annexin V-FITC／PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，貨號556547）；Cleaved-Caspase Ab Sampler Kit（美國 CST 公司，批號 8072965）；GAPDH（貨 號sc-32233）、HRP 標記羊抗鼠二抗（貨號SA00001-1-A）和兔二抗（貨號SA00001-2）購自美國Proteintech 公司。

1.2 儀器 電熱恒溫水浴箱（型號AODHG-HH-W600）購于山東濟南赫威科技有限公司；BIOBASE 博科二氧化碳細胞培養箱（型號QP-80）、BIOBASE 博科酶標儀（型號EL-10 A）均購于山東濟南飛捷醫療設備有限公司；臺式高速低溫離心機（型號TGL-20M）購于山東濟南赫威科技有限公司；光學顯微鏡（型號LB-270）購于北京世聯博研科技有限公司；流式細胞儀（型號BD-Accuri-C6）購于北京科譽興業科技有限公司；伯樂蛋白電泳儀（型號C1000）購于美國Bio-Rad 公司。

2 方法

2.1 藥物溶液制備 稱取一定量的姜黃素粉劑，DMSO 溶解，配成100 mmol／L 貯備液，-20 ℃保存，使用前用培養液稀釋成所需的濃度，并使所含DMSO 小于0.1%。據文獻記載，進口DMSO 濃度在0.1% 以下對細胞抑制增殖無影響［9-10］，故本實驗忽略0.1% DMSO 影響，僅設立空白對照組及姜黃素組。

2.2 細胞培養 結腸癌SW620、HCT-8、LOVO、HCT-116、SW480 細胞株均購自浙江省腫瘤研究所。結腸癌細胞株在含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培養基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，0.25% 胰蛋白酶消化3 min，以1∶2～1∶4 比例傳代。

2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制作用 取對數生長期細胞，以3 000／孔接種于96 孔板中，培養24 h；姜黃素組加入姜黃素（1、2、4、8、16、32 μmol／L），5-FU 組加入5-FU（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 μmol／L），對照組予以含有10% 胎牛血清的1640 或DMEM 培養基；各組繼續培養24、48 h，加入MTT 孵育4 h，加入DMSO，全自動酶標儀測定OD（570 nm），計算細胞增殖抑制率｛ ［（OD對照組-OD給藥組）／OD對照組］×100%｝。

2.4 姜黃素聯合5-FU 協同作用SW620 細胞的檢測 取對數生長細胞，以3 000／孔接種于96 孔板中，預處理姜黃素聯合5-FU：細胞培養24 h，加入姜黃素預處理24 h，吸出舊培養基，加入5-FU 繼續干預48 h，MTT 檢測。姜黃素同時聯合5-FU：細胞培養24 h，吸出舊培養基，加入姜黃素和5-FU 共同干預48 h，MTT 檢測。

Chou-Talalay 又稱中位藥效法（median-drug effect analysis）、聯合指數法（combination index method），是用于研究藥物協同作用的定量分析。2005 年Martin 等［11］對Chou-Talalay 的數學模型開發了第3 代藥物聯合作用量-效分析軟件“CompuSyn”，且成為當代抗腫瘤藥物聯合作用研究的最普遍方法之一。Chou-Talalay 根據Median-effect方程（藥物自身藥動學及藥物之間藥效學聯系）衍生出新的數學模型［12］，關于該模型細節操作詳見參考文獻［11-14］。

聯合指數（combination index，CI）不僅描述藥物拮抗作用、相加作用及協同作用，同時對定量-效應水平下的效應進行定性描述。Median-effect 方程曾導出兩藥聯合CI公式為CI＝（D）1／（DX）1+（D）2／（DX）2，D為單用劑量，DX 為聯合劑量，具體推導公式見參考文獻［12］。如今，在確定藥物數量、有無拮抗作用和劑量選擇條件下，先根據MTT 獲得的量-效關系進行等效量和等量效比較，最后應用“CompuSyn”（基于Chou-Talalay 模型應用），軟件輸入計算CI，從而分析藥物間聯合效應，即CI＞1為拮抗作用，CI＝1 為相加作用，CI＜1 為協同作用。

2.5 流式細胞儀檢測SW620 細胞的凋亡率 培養對數生長期細胞，制成細胞懸液（1×105／mL），以2 mL／孔接種于6 孔培養板中，并置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，棄去舊培養液，加入含不同濃度姜黃素的培養基1 mL，預處理24 h 后，棄培養基并分別加入相應濃度的氟尿嘧啶培養48 h，收集細胞，500×g離心5 min、PBS洗滌，加入染色緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，混勻后再加入PI 染料10 μL，避光室溫反應20 min。最后將細胞放入流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

2.6 Western blot 檢測凋亡相關蛋白表達 按照“2.5”項下條件培養細胞。收集細胞，RIPA 裂解液提取蛋白。在預制凝膠板中上樣，電泳100 V、1 h 轉膜200 mA、2 h，封閉1 h，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育2 h，最后進行圖像采集和分析。

2.7 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 姜黃素與5-FU 對結腸癌細胞株增殖的抑制作用 MTT結果顯示，5-FU 處理SW620 細胞48 h，IC50為（367.20±16.80）μmol／L，其對SW620 細胞抑制作用較弱（表1～2）；姜黃素（1～32 μmol／L）處理SW620 細胞24、48 h，能抑制SW620 細胞增殖（P＜0.01）（表3）。48 h 藥物暴露處理所得的實驗結果最佳，選擇SW620 細胞開展姜黃素對5-FU 增敏作用的研究。

表1 5-FU 處理48 h 后對結腸癌細胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表1 5-FU 處理48 h 后對結腸癌細胞株增殖的抑制作用（±s，n＝3）

表2 5-FU 對SW620 細胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表2 5-FU 對SW620 細胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：與對照組比較，??P＜0.01。

表3 姜黃素對SW620 細胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

表3 姜黃素對SW620 細胞增殖的抑制作用（±s，n＝6）

注：與對照組比較，??P＜0.01。

根據CompuSyn 軟件（www.combosyn.com）計算藥物聯合的協同效應，發現姜黃素能增加SW620 對5-FU 的敏感性，且姜黃素預處理相比于兩藥同時干預有更顯著的增敏效果（表4～5），劑量-效應曲線見圖1～2。

表4 姜黃素同時聯合5-FU 對SW620 協同效應的影響

表5 預處理姜黃素聯合5-FU 對SW620 協同效應的影響

圖1 姜黃素同時聯合5-FU 處理SW620 效應曲線

圖2 預處理姜黃素聯合5-FU 處理SW620 效應曲線

3.2 姜黃素與5-FU 聯用對SW620 凋亡的影響 姜黃素預處理組比同時用藥聯合組對SW620 生長抑制更明顯，因此采取姜黃素預處理培養細胞的方法進行凋亡檢測。流式細胞分析發現，與對照組比較，聯用給藥組誘導SW620 細胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），見表6、圖3。

3.3 姜黃素與5-FU 聯用對SW620 細胞相關凋亡蛋白表達影響 單用姜黃素對SW620 細胞內caspase 家族蛋白表達，差異無統計學意義（P＞0.05），單用5-FU 促進cleaved-PARP 和cleaved-caspase3 蛋白表達（P＜0.05），應用姜黃素預處理與5-FU 聯用促進SW620 細胞caspase 家族相關凋亡蛋白（cleaved-PARP、cleaved-caspase3、cleaved-caspase6、cleaved-caspase9）表達（P＜0.01），見圖4、表7。由此提示，姜黃素與氟尿嘧啶（5-FU）聯用可以協同誘導SW620細胞內相關促凋亡蛋白表達。

4 討論

5-FU 作為結直腸癌治療最普遍、療效相對高的化療藥物［15］，它在人體內會轉變為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸，繼而抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，從而阻斷尿嘧啶脫氧核苷轉變為胸腺嘧啶脫氧核苷，最終影響DNA 和RNA 的合成［16］。但5-FU 的長期應用會導致胃腸及血液系統的毒副作用，甚至產生對5-FU 的藥物耐受，這會嚴重影響患者生存質量及抗腫瘤治療［17］。

表6 姜黃素聯合5-FU 對SW620 凋亡率的影響（±s，n＝3）

表6 姜黃素聯合5-FU 對SW620 凋亡率的影響（±s，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

結腸癌細胞對5-FU 產生耐受是化療藥物療效降低的重要原因之一。已有相關研究［18］證實，姜黃素主要通過調節抑癌基因和原癌基因表達，誘導細胞凋亡，逆轉腫瘤細胞耐藥等途徑表現抗腫瘤活性。同時，發現姜黃素能上調P53 和Bax，下調Bcl-2，由此誘導結腸癌細胞凋亡［19］。此外，Mehdi 等［20］發現5-FU 與姜黃素的聯合應用可以阻斷結腸癌發展，結果顯示，在聯用的情況下，結腸癌HCT116細胞存活率顯著降低，產生細胞周期阻滯并誘導凋亡。此外，還觀察到姜黃素可通過NF-κB 信號通路增強5-FU 對結腸癌細胞株生長抑制和促凋亡作用。諸多研究表明，姜黃素作為中藥的提取成分，雖不及化療藥物療效但也具備抗腫瘤作用。因此，探索姜黃素與5-FU 聯用對抗腫瘤作用的研究有重大意義，本研究也將為姜黃素作為未來臨床輔助化療藥的增效劑提供理論依據。

圖3 姜黃素聯合5-FU 誘導SW620 凋亡的流式圖

圖4 姜黃素聯用5-FU 對SW620 細胞內相關凋亡蛋白的表達

在本研究中，首先通過MTT 法對5-FU 抑制結腸癌相關細胞株HCT-8、HCT-116、LOVO、SW480、SW620 的生長作用進行對比，得到5-FU 處理以上細胞株48 h，IC50分別為24.62、12.38、4.53、18.49、367.20 μmol／L。由此可知，相比于其他4 株細胞，SW620 對5-FU 的敏感性較弱，針對其展開后續增敏相關實驗更具有臨床依據及意義。從細胞增殖、細胞凋亡、凋亡相關蛋白表達等幾個方面分析姜黃素與5-FU 聯用對SW620 抑制作用。通過CompuSyn軟件計算分析發現兩種藥物聯合應用時，姜黃素可明顯增進5-FU 對SW620 的殺傷作用，而預處理24 h 相比于同時用藥有更明顯的效果。為進一步了解姜黃素與5-FU 抑制SW620 增殖的機制，利用FITC-Annexin V／ PI 雙染流式細胞技術對SW620 細胞凋亡進行了檢測，結果顯示兩藥聯用（預處理組）比單藥處理發生的凋亡更顯著，提示姜黃素可能通過誘導SW620 凋亡來增加其對5-FU 的敏感性。8 μmol／L姜黃素預處理與5 μmol／L氟尿嘧啶（5-FU）聯用組能上調SW620 細胞內caspase 家族相關蛋白表達，說明預處理姜黃素與5-FU 聯用能協同誘導SW620 細胞內相關凋亡蛋白表達。

表7 姜黃素聯用5-FU 對SW620 細胞內相關凋亡蛋白的表達（±s，n＝3）

表7 姜黃素聯用5-FU 對SW620 細胞內相關凋亡蛋白的表達（±s，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

綜上所述，預處理姜黃素聯用5-FU 協同增強對SW620細胞株的殺傷作用，其機制與caspase 半胱氨酸蛋白酶家族有關。有研究［21］顯示，腺病毒載體導人caspase-3 基因在獲得性藥物抗性（acquired drug resistance，ADR）的MCF-7細胞系中發現ADR 細胞比轉入前caspase-3 蛋白表達增加，同時也發現前體caspase-3 高表達，對藥物的敏感性強。表示caspase 在未來治療惡性腫瘤化療藥耐藥性方面具有重要實際意義，且用caspase 相關誘導凋亡的方法治療腫瘤將有新的潛能和突破。本實驗為臨床上姜黃素作為結腸癌化療藥5-FU 的增效劑，減少毒副作用和耐藥性提供了初步實驗依據，但仍需要進一步的研究驗證。