絨毛訶子對小鼠毒性的影響

王晨曉，馬貝貝，天 宇，梁耀月，高 陽，左澤平，王志斌

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.北京市藥品檢驗所，北京 100035；3.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 100029）

訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實［1］，是蒙藥、藏藥等民族藥的常用藥，原產于印度、斯里蘭卡、緬甸，在國內嶺南也有分布，云南為訶子的道地產地，有8 個變種：絨毛柯子、恒河訶子、檸檬色訶子、馬來亞訶子、斯里蘭卡訶子、粗毛葉訶子、矮訶子、銀葉訶子［2］。訶子性平和，酸苦澀三味并具，歸肺經、大腸經，能止咳止瀉、斂肺澀腸、利咽降火等，常用于治療長咳不止、脫肛便血、喉痛音啞、長痢久瀉、肺虛咳喘等多種病癥，更是臨床治療失音的良藥，與余甘子、毛訶子組成三果湯散，可單獨使用，或配伍其他藏藥組成復方［3］。在蒙醫藏醫中，訶子用于治療“龍”病、“赤巴”病、“培根”病［4］，廣泛用于調和藥性、消除病邪、解毒、生肌長骨等方面［5］。現代藥理學研究［6］表明，訶子有抗金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌，抗真菌，抗氧化，抗誘變作用，還有一定的解痙鎮咳作用，其所含訶黎勒酸、訶子酸等有抗腫瘤和降糖作用，也對治療阿爾茨海默病有一定療效。

訶子的藥理作用多有研究，但對毒性方面少有報道。Prabal Ghosh 等［7］研究了不同溶劑的訶子提取液對雄激素關鍵酶（D5、3β-HSD、17β-HSD）與血清睪酮水平的影響，結果表明，訶子水提液顯著上調睪丸Bax基因和下調Bcl-2 基因，導致睪丸活性成分較低，流式細胞檢測發現精子活力明顯降低，表明訶子通過減少睪丸基因組傳感器并提升可能導致男性避孕的精子凋亡傳感器發揮避孕作用。研究［8］表明，在重復劑量28 d 的口服毒性研究中，給予1 000 mg／kg 80%乙醇訶子提取物后，小大鼠食物攝入量和飲水量明顯減少，葡萄糖和AST 水平顯著變化，表明肝腎功能紊亂；在組織病理學篩查中，口服給藥組在肝臟中顯示出輕微的肉芽腫性炎癥，所有其他器官正常，在28 d后，訶子提取物會導致肝臟和腎臟功能輕度紊亂。本課題組前期通過小鼠急性毒性實驗和大鼠亞急毒性實驗，發現訶子靶器官是肝臟，整體動物實驗與高內涵篩選分析技術技術在毒性結果判斷上有一致性［9］。由于國外并沒有指出訶子具有明顯的肝毒性和受試動物死亡的現象，故相關是不可或缺的。

1 材料

1.1 動物 ICR 小鼠70 只，SPF 級，雌雄各半，購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京市藥檢所藥理毒理室，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2015-0033。

1.2 藥材與試劑 訶子 ［北京同仁堂總店（大柵欄店）］，經北京市藥檢所中藥室主任陳友根老師經鑒定為絨毛訶子，產地為云南。苦味酸（批號20180527，天津華特化研科技有限公司）；滅菌注射用水（批號1809013205，石家莊四藥有限公司）；甲醛（批號20180606，北京益利精細化學品有限公司）；丙氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒（ALT，批號180841）、天門冬氨酸氨基轉移酶檢測試劑盒（AST，批號180791）、總蛋白檢測定試劑盒（TP，批號180771）、總膽固醇檢測試劑盒（CHO，批號181611）、總膽紅素檢測試劑盒（TBIL，批號180891）、尿素檢測試劑盒（Urea，批號180901）、肌酸激酶檢測試劑盒（CK，批號180851）、堿性磷酸酶檢測試劑盒（ALP，批號180951）、γ-谷氨酰基轉移酶檢測試劑盒（GGT，批號181001）、肌酐檢測試劑盒（Crea，批號180671）、白蛋白檢測試劑盒（ALB，批號180831）、甘油三醋檢測試劑盒（TG，批號180811）、葡萄糖檢測試劑盒（GLU，批號180831）均購自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 儀器 TE2101-L、BS224S 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；AU400 生化儀（日本Olympus 光學株式會社）；DM3000 光學顯微鏡、EG1150H 組織包埋機、RM2245 半自動切片機、Auto Stainer×1 染色、HI1210烤片機、ASP-200 組織脫水機、HI1210 攤片機（德國Lecia公司）；Multifuge X3 R 高速冷凍離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］。

2 方法

2.1 訶子水煎液制備 把絨毛訶子去除雜質和核，加8 倍量蒸餾水浸泡60 min，用煮藥砂鍋煎煮2 次，合并藥液，濃縮，得2 g／mL 水煎液。使用前，用滅菌注射用水將其配制成組間劑量系數為0.85 的不同質量濃度藥液，T2～T7 組給藥劑量分別為35.7、30.34、25.79、21.92、18.63、15.83 g 生藥／kg，相當于人用最大劑量的278、237、201、181、145、123 倍。

2.2 絨毛訶子水煎液半數致死量測定 根據隨機數表將70 只ICR 小鼠（雌雄各半）分為7 組，依次為T1～T7 組，T1 組為對照組，T2～T7 組為“2.1”項下給藥劑量，每組10 只，雌雄各半。所有動物均處于SPF 級屏障系統，溫度控制在（24±2）℃，每天12 h 光照／12 h 暗室，并給予充足的飲用水和標準的顆粒飼料喂養。給藥前禁食12 h，各給藥組小鼠分別一次性灌胃不同濃度的藥液，給藥量為0.1 785 mL／10 g；對照組小鼠灌胃等體積的滅菌注射用水，給藥后，禁食4 h。

在灌胃給藥后6 h 內，認真觀察小鼠的生理狀況［飲水情況及其對外反應情況（如瞳孔反應）］。在其后6～12 h，每隔2 h 觀察記錄1 次。從給藥后的第2 天開始，每天觀察記錄1 次動物的基本狀況，著重于運動行為（背部是否出現弓起或強直、怪叫、豎尾、腹部抽搐、俯臥還有其自主神經活動，如豎毛等）及其異常情況（如大小便異常或其他分泌物）。小鼠分別在第0、1、3、5、7、9、11、13、14 天上午9：00 稱定質量，仔細記錄出現異常癥狀小鼠的數量、癥狀開始時間、結束時間、死亡時間等。觀察結束后，所有存活小鼠麻醉，打開腹腔，腹主靜脈取血，全血4 ℃、2 500 r／min 離心15 min，分離血清，測定生化指標，肉眼觀察體內臟器病變情況。觀察結束后，迅速取出肝臟與腎臟，于預冷的生理鹽水中漂洗數次，稱定質量，取肝臟大葉中部、腎臟，10%中性福爾馬林溶液固定。

2.3 絨毛訶子蓄積毒性實驗 采用20 d 定期遞增劑量法評價絨毛訶子水煎液的蓄積毒性作用。取ICR 小鼠60 只（雌雄各半），對照組20 只，給藥組40 只。對照組以灌服滅菌注射用水組為陰性對照；給藥組小鼠每天灌胃絨毛訶子水煎液，第一階段的的劑量為0.1LD50，第二階段的劑量為0.15 LD50，4 d 為一階段，以此類推。連續灌胃20 d 后終止實驗，計算蓄積系數，實驗期間觀察給藥小鼠的一般狀況并記錄體質量（“2.2”項下觀察一樣），灌胃劑量如表1 所示。

表1 蓄積毒性遞增劑量法染毒方案（g／kg）

2.4 小鼠生化指標檢測 急性毒性觀察14 d，蓄積毒性在20 d 末次給藥后，禁食不禁水12 h，處死存活小鼠，進行腹主靜脈取血，全血4 ℃、2 500 r／min 離心15 min，分離血清，進行相關生化檢測。反映膽汁淤積的主要指標有ALP、GGT，反映肝臟受損的主要指標有AST、ALT，反映肝臟膽排泄、分泌及解毒功能的主要指標有TBIL。

2.5 小鼠體質量、肝臟指數計算 在急性毒性實驗中，每日觀察存活小鼠情況，并隔日稱定體質量。觀察期結束時并取血結束后，摘取小鼠肝、腎精密稱定質量，計算其臟器指數。在蓄積毒性實驗中，每日同樣時間對小鼠稱定體質量并觀察現象，20 d 實驗結束后禁食12 h，取其心、肝、脾、腎、肺等重要臟器，計算各臟器指數。

2.6 病理切片觀察 實驗結束時，肉眼觀察體內臟器病變情況。觀察結束后迅速摘取小鼠心、肝、脾、肺、腎，于預冷的生理鹽水中漂洗數次，并稱定質量，將主要臟器用10%中性福爾馬林溶液固定，制作病理切片，而后常規修整蠟塊、脫水至透明、浸蠟、包埋、切片并進行HE 染色，在顯微鏡下觀察病理組織變化。

2.7 統計學分析 使用SASS9.4 軟件進行統計分析，數據以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 急性毒性實驗

3.1.1 急性毒性癥狀和體質量變化 口服給藥后6 h 內，高劑量組（T2、T3 組）小鼠活動減少、安靜、背毛凌亂、扎堆抱團，至給藥后12 h，出現呆臥少動，腹瀉、水樣下痢，未出現死亡現象。小鼠初步出現死亡現象的時間在12～24 h 內，集中死亡現象的時間在24～72 h 內，3 d 后無死亡。死亡前，小鼠會出現走路不穩、昏睡、呼吸衰竭、正向反射消失、嘴角有明顯分泌物，死象掙扎，未見其他異常癥狀。對其及時剖檢，觀察其臟器的顏色、外形、質地等情況，發現死亡小鼠肝臟與正常小鼠肝臟比較，顏色有明顯變化，其他臟器未見異常。

存活實驗小鼠與對照組相比，體質量增長緩慢。給藥組小鼠在灌胃24 h 后，體質量減輕，T2、T3、T4、T5、T6、T7 組的小鼠出現了負增長。見圖1。

圖1 絨毛訶子水煎液對小鼠體質量的影響

3.1.2 LD50各劑量組小鼠出現死亡的時間隨劑量減少而后移，見表2、圖2。絨毛訶子按生藥量計算，其LD100為30.34 g／kg，相當于人常用劑量的237 倍（《中國藥典》 規定訶子臨床劑量是3～9 g，對于70 kg 成人，臨床上每日可用的最大劑量是0.128 g 生藥），其LD50為18.926 g 生藥／kg，LD50（Feiller 校正）95%的可信限為17.026～20.62 g生藥／kg，為人最大日用量的147.8 倍。

3.1.3 血清生化指標 如表3 所示，與對照組比較，給藥組小鼠血清ALT、AST、TP、ALB、GLO、A／G、TBIL、TG、GLU、ALP 水平上升（P＜0.05，P＜0.01），Crea、CK 水平下降（P＜0.01）。

3.1.4 肝腎臟器指數 各組小鼠主要臟器心、脾、肺和腎均未見病變等異常，而肝臟有明顯顏色變化。與對照組對比，T6 組肝、腎臟器指數有差異（P＜0.01），T7 組肝、腎臟器指數無差異（P＞0.05），見表4。

3.1.5 肝腎臟器病理切片 在光鏡下，對照組小鼠肝細胞完整、排列規則、肝竇未見明顯淤血擴張；實驗組小鼠出現了明顯的肝細胞腫脹，細胞核增大，胞漿疏松淡染，吞噬了色素的枯否氏細胞，多見于中央靜脈周圍，有1 例出現了肝細胞壞死現象。與對照組相比，給藥組小鼠有3 只腎臟病變嚴重，表現為腎小管的局灶性病變、腎小管上皮細胞數量增加、細胞核大小不等、淡然胞漿較少嗜堿性，病灶內還可見顆粒管型，透明管型和腎小管囊性擴張等病變。見圖3。

表2 小鼠灌胃絨毛訶子水煎液后不同時間的死亡數

圖2 絨毛訶子不同劑量組小鼠累積死亡數—時間曲線

3.2 蓄積毒性

3.2.1 臨床表現 小鼠在給藥后第1 階段，飲食、進水、小大便皮毛狀況、日常活動表現、體質量增長正常。在給藥后的第2、3 階段，小鼠背毛凌亂，腹瀉，呆臥少動，體質量增長緩慢，未出現死亡。在給藥后第4 階段，小鼠出現死亡，腹部出現輕微鼓脹現象，進食量減少，活動減少，給藥組雄性小鼠體質量出現了負增長。在給藥后第5 階段，小鼠腹脹情況加重，進食量減少，精神萎靡，反應遲鈍，給藥組小鼠體質量與第2 階段相比無差異。見圖4。

表3 絨毛訶子水煎液處理14 d 后對小鼠血清生化指標的影響（±s）

表3 絨毛訶子水煎液處理14 d 后對小鼠血清生化指標的影響（±s）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P ＜0.01。

表4 絨毛訶子水煎液對小鼠肝腎臟器指數的影響（±s）

表4 絨毛訶子水煎液對小鼠肝腎臟器指數的影響（±s）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P ＜0.01。

圖3 小鼠肝腎器官組織學形態

圖4 絨毛訶子水煎液對大鼠蓄積毒性體質量的影響

蓄積毒性死亡情況見表5，總計死亡10 只，K＝LD50（n）／LD50（1），LD50（n）為每只動物共攝入受試物相當的LD50數，LD50（1）為受試物的經口LD50。20 d 連續給藥后，給藥劑量已達到5.26 LD50，死亡數未過半，此時蓄積系數K＞5，按蓄積毒性分級標準［10］，K＜1，高度蓄積；1≤K＜3，明顯蓄積；3≤K＜5，中等蓄積；K≥5，輕度蓄積。由此可知，絨毛訶子為輕度蓄積。

表5 蓄積毒性實驗大鼠死亡情況

3.2.2 臟器指數 各組小鼠主要臟器心、脾、肺和腎均未見病變等異常，肝臟呈現灰黃色，表面不光滑，有明顯的顏色變化。腹脹小鼠經解剖后發現，腸道和胃里有大量氣體。與對照組比較，雄性給藥組心、肝、肺臟器指數增加（P＜0.05，P＜0.01），雌性給藥組肝臟指數增加（P＜0.01）。見表6。

3.2.3 血清生化指標 與對照組比較，給藥組小鼠血清ALT、AST、TP、ALB、GLO、A／G、CK 水平升高，TBIL、Urea 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表7。

3.2.4 肝腎臟器病理切片 在16 只雄性小鼠中，2 只出現肝壞死，表現為肝細胞腫脹，胞漿稀薄、淡然，細胞核仁大，染色質聚集；1 例有小壞死灶；4 例出現腎小管局灶性病變，表現為腎小管上皮細胞數量增加、細胞核大小不等、淡然胞漿較少嗜堿性。對照組肺細胞結構完整；給藥組肺泡結構破壞，被炎細胞浸潤，有肉芽腫性炎癥；2 組心、脾均未見明顯異常。

表6 絨毛訶子蓄積毒性實驗大鼠臟器指數（±s）

表6 絨毛訶子蓄積毒性實驗大鼠臟器指數（±s）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

表7 絨毛訶子蓄積毒性生化指標（±s）

表7 絨毛訶子蓄積毒性生化指標（±s）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4 討論

訶子在《中國藥典》 中有2 個基源，一個是使君子科植物訶子，另一個是絨毛訶子，經過河北安國實地調查和在北京各藥房采購調研發現，有些藥商賣出藥材標明為使君子科訶子，但經專家鑒定后為訶子的其他變種，例如恒河訶子和大訶子。課題組前期已經對使君子科訶子做了毒性靶器官的探討，但查詢國內外相關文獻發現，鮮有對絨毛訶子的相關研究。

圖5 蓄積毒性小鼠器官組織學形態

本實驗用14 d 急性毒性和20 d 蓄積毒性實驗相結合的方法來探討絨毛訶子的毒性，為合理用藥提供參考。通過急性毒性實驗，確定絨毛訶子LD50為18.926 g 生藥／kg，是70 kg 人最大日用量的147.8 倍；給藥劑量為人常用劑量的145 倍時，其肝臟、腎臟指數與對照組相比差異具有統計學意義，結合血清生化指標，ALT、AST、TP、ALB、GLO、A／G、TBIL、Crea、CK、TG 水平與對照組相比也有顯著差異，表明小鼠肝臟和腎小管都出現了不同程度的損傷，推測絨毛訶子的急性毒性靶器官可能是肝臟和腎臟。

20 d 蓄積毒性實驗是在一定期限內，以低于致死劑量的標準確定給藥劑量后每日染毒，以此判斷藥物毒性在代謝過程中是否有蓄積現象。絨毛訶子在蓄積毒性中，其蓄積系數為K＞5，為輕度蓄積，同時小鼠體質量增長緩慢。在前3 個階段時，給藥組小鼠與正常組相比，日常表現都正常；在第4、5 階段，給藥組小鼠活動遲緩、背毛凌亂、腹瀉、腹漲、呆臥不動現象明顯。通過觀察蓄積毒性靶器官，雄性給藥小鼠與對照組小鼠相比心肺、肝臟指數有統計學差異，推測給藥過程中小鼠有脹氣、進食不順、心肺供應消耗不足，造成萎縮；雌性給藥小鼠與對照組比較，肝臟指數差異有統計學意義。結合生化指標和病理切片的結果來推測，絨毛訶子蓄積毒性的靶器官不如急性毒性明確，蓄積毒性不高，可能與小鼠的日常代謝有關，由于多次反復給藥過程中毒性物質可能在體內有一定的降解，故一次性給藥和多次反復給藥的主要毒性靶器官可能有所不同。

訶子中的主要成分為鞣質類及酚酸類，包括沒食子酸、沒食子酰葡萄糖等。研究［11］發現，何首烏中沒食子酸對肝細胞具有損傷作用，可能為何首烏致肝損傷的主要成分；吳宇等［12］采用細胞毒性篩選、高內涵技術探索沒食子酸對HepaRG 肝細胞損傷的機理，它可有劑量依賴性地誘導細胞凋亡，并通過分子生物學技術篩選出11 個差異蛋白，集中在內質網的功能蛋白折疊加工方面。但訶子致肝毒性的物質基礎及其作用機制尚不明確，需要作進一步的研究。