復方七芍降壓片對SHR 大鼠IL-8、IL-10 水平及AP-1、MCP-1 蛋白表達的影響

任衛瓊李 弘劉葉倩龔 姍劉 林王宇紅?

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

近10 年，我國成年人中約有30%患有高血壓，其中一部分伴隨著冠狀動脈疾病、中風和心力衰竭等的發生［1-2］，高血壓是導致人類死亡的重大疾病之一，我國患者以原發性高血壓為主，其發生、發展機制復雜，是在炎癥、神經-免疫因素等多種因素的相互作用下導致的［3］。近年來，炎癥與高血壓的相關性已成為研究的熱點，國內外文獻均報道炎癥與高血壓的發生、發展及轉歸密切相關［4］，文獻［5-6］報道通過調控激活子蛋白-1（AP-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），會影響炎癥因子的釋放。課題組前期研究發現，復方七芍降壓片對高血壓患者具有較好的治療作用，其機制與改善炎癥有關，但該方是否通過AP-1、MCP-1 通路影響炎癥因子的釋放發揮調控血壓的作用尚不明確。因此，本實驗采用復方七芍降壓片干預自發性高血壓大鼠（SHR），觀察其對SHR 的降壓作用及對炎癥因子白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-10（IL-10）水平和AP-1、MCP-1 蛋白表達的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級、6～7 周齡雄性SHR 大鼠30 只，體質量130～150 g；6～7 周齡雄性WKY 大鼠10 只，體質量130～150 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號11400700359571，動物生產許可證號SCXK（京）2016-006，實驗動物環境設施合格證號SYXK（湘）2015-0003。

1.2 試劑與藥物 復方七芍降壓片（0.46 g／片，批號20181026），人臨床用量為12 片，相當于含生藥量97 g，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科制備；厄貝沙坦片（75 mg／片，批號17122111），人臨床用量為300 mg／d，購自揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司；IL-8、IL-10 檢測試劑盒（批號20190305，上海晶天生物科技有限公司）；c-jun（批號AI03113818）、MCP-1（批號AB05105689）一抗購自美國Bioss 公司。

1.3 儀器 AUW2200 型分析天平（日本島津公司）；BP2010 型無創血壓檢測儀（北京軟隆科技有限公司）；H1850 型低速臺式離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；BMJ-1n 型病理組織包埋機、包埋冷凍臺（上海珂淮儀器有限公司）；TS-12F 型生物組織自動脫水機（上海華巖儀器設備有限公司）；UC-7 超薄切片機（北京冠普佳科技有限公司）；日立HT7700 透射電鏡（上海天美科學儀器有限公司）；OLYMPU 倒置顯微鏡和照相裝置（日本Olympus 公司）；KS400 型圖像分析儀（德國Zisse 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 30 只SHR 大鼠根據體質量、血壓，隨機分為模型組、厄貝沙坦片組、復方七芍降壓片組，每組10 只；另設10 只WKY 大鼠為正常對照組。正常對照組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水，厄貝沙坦片組大鼠給予厄貝沙坦片混懸液（27 mg／kg），復方七芍降壓片組大鼠給予復方七芍降壓片藥液［8.73 g／kg（生藥）］，給藥體積為10 mL／kg，灌胃給藥1 次／d，連續給藥6 周，每周測量1次血壓和體質量。

2.2 血壓測定 分別在給藥前及給藥第1、2、3、4、5、6周早上8：00～12：00，采用無創血壓儀測量大鼠給藥后1 h尾動脈壓，每只測量3 次，取平均值。

2.3 透射電鏡觀察腸系膜動脈超微結構 取腸系膜上動脈（二級分支）于2.5%戊二醛中固定，4 ℃過夜，1%鋨酸固定液固定1～2 h，丙酮梯度脫水、浸泡、包埋，37 ℃烘烤過夜固定，切超薄片（50～100 nm），3% 醋酸鈾、硝酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察并拍照。

2.4 ELISA 法檢測血清中IL-8、IL-10 水平 在末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后采取腹主動脈血于血清管中（不抗凝），靜置2 h，離心（4 500 r／min）10 min，取上清于1.5 mL 離心管中，貯存于-80 ℃冰箱。嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟，測定血清中IL-8、IL-10水平。

2.5 免疫組化檢測AP-1、MCP-1 蛋白表達 取腸系膜上動脈（二級分支），生理鹽水清洗干凈，4%多聚甲醛固定，浸蠟包埋，切厚度為5 μm 的切片，二甲苯脫蠟，酒精逐級脫水，一抗孵育4 ℃過夜，二抗孵育，DAB 顯色，復染，脫水封片。光鏡顯微鏡下，觀察腸系膜動脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達。

2.6 統計學分析 應用SPSS19.0 軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較先進行方差齊性檢驗，方差齊者采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；方差不齊者采用秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 復方七芍降壓片對SHR 大鼠體質量的影響 給藥前，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠體質量在前4 周上升較快，之后增加有所減慢，可能與年齡增長有關，提示藥物治療6 周對大鼠體質量影響較小。見圖1。

3.2 復方七芍降壓片對SHR 大鼠收縮壓的影響 給藥前，與正常對照組比較，模型組、厄貝沙坦片組、復方七芍降壓片組大鼠收縮壓更高（P＜0.01）。藥物治療后，與正常對照組比較，模型組大鼠各周收縮壓均上升（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠各周收縮壓均下降（P＜0.01），以厄貝沙坦片組降壓效果更優。見圖2。

圖2 復方七芍降壓片對SHR 大鼠收縮壓的影響

3.3 復方七芍降壓片對SHR 大鼠腸系膜動脈超微結構的影響 正常對照組大鼠動脈血管內皮細胞扁平，排列整齊、緊密，體積較小，偶見散落的內皮細胞，核正常；平滑肌細胞形狀規則，均勻分布，細胞核完整，核膜光滑，染色質分布均勻；細胞外基質較少，無明顯的膠原纖維。與正常對照組比較，模型組大鼠動脈血管內皮細胞與動脈內膜脫離，體積增大，細胞核水腫，呈高柱狀突入血管管腔；平滑肌細胞增多，呈不規則形狀，體積顯著增大，排列不規則，細胞核固縮凋亡；細胞外基質及膠原纖維明顯增多。治療6 周后，與模型組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠動脈得到顯著改善，內皮細胞體積明顯縮小，與動脈內膜連接較為緊密，細胞核顯著減小，未見呈高柱狀突入血管管腔的內皮細胞；平滑肌細胞分布均勻，體積未見明顯增大，形狀較為規則，細胞核略有皺縮；細胞外基質及膠原纖維增多不明顯。見圖3。

3.4 復方七芍降壓片對腸系膜動脈中AP-1、MCP-1 蛋白表達影響 正常對照組大鼠動脈中陽性染色較弱；模型組大鼠動脈陽性染色較強，內膜部分脫落，中膜平滑肌細胞遷移、排列不規則；厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠動脈陽性染色較弱，中膜平滑肌細胞未見明顯增殖，排列整齊，內膜損傷得到改善。陽性染色多見細胞質和細胞核中。與正常對照組比較，模型組大鼠動脈中AP-1、MCP-1蛋白表達均增加（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組大鼠動脈中AP-1、MCP-1 蛋白表達均降低（P＜0.05）。見圖4～5。

3.5 復方七芍降壓片對SHR 大鼠血清中IL-8、IL-10 水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清中的IL-8 水平升高，IL-10 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦片組和復方七芍降壓片組血清中IL-8 均降低，IL-10水平均升高（P＜0.05）。見圖6。

4 討論

圖3 各組大鼠腸系膜動脈壁超微結構（5 μm）

圖4 各組大鼠腸系膜動脈AP-1、MCP-1 蛋白表達（免疫組化，×400）

圖5 各組大鼠腸系膜動脈AP-1、MCP-1 平均光密度

圖6 各組大鼠血清中IL-8、IL-10 水平

高血壓是常見的心血管疾病之一，在全球具有較高的發病率和致死率［7］。炎癥因子（IL-1、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子-α 等）可以損傷血管內層的內皮細胞及中層的血管平滑肌細胞，引起血管壁的病理變化（如管腔狹窄等），造成血管阻力升高，在高血壓的發生、發展過程中發揮著重要的作用［8］。因此，保護血管內皮細胞和平滑肌細胞的正常功能，對于保護血管，防治高血壓極其重要。本研究在電鏡下觀察到，模型組大鼠腸系膜動脈內皮細胞脫落、水腫，平滑肌細胞增殖、核凋亡，推測在高血壓狀態下，血管壁發生病理變化，造成血管阻力升高，升高血壓；與模型組比較，復方七芍降壓片組內皮細胞體積縮小，與內膜連接緊密，平滑肌細胞分布均勻，體積較正常。

IL-8、IL-10 均為白細胞介素家族中的一員，與高血壓密切相關，但IL-8 是一種促炎因子，其對高血壓的病情起著促進的作用，其可損傷內皮細胞，與高血壓病情程度呈正相關［9］；IL-10 是一種抗炎因子，其可以抑制IL-1、IL-8、TNF-α 等促炎因子的產生，減輕炎癥損傷，并可以改善內皮功能，抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移，進而降低血壓，改善血管重塑［10-11］。有研究發現，抵當湯可以通過降低高血壓急性期患者血清中IL-8 水平，升高IL-10 水平，來減輕炎癥反應，降低血壓［12］。本研究發現，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-8 水平增高、IL-10水平降低，血壓升高，推測在高血壓病理條件下，炎癥水平升高，損傷血管，促進高血壓發展；與模型組比較，復方七芍降壓片組大鼠血清中炎癥因子IL-8 水平降低、IL-10水平升高，血壓降低。

AP-1 是存在于真核細胞中的轉錄激活因子，主要由原癌基因編碼的蛋白質Jun 和Fos 組成。在血管內皮細胞、平滑肌細胞等不同的細胞中，AP-1 的激活夠能誘導多種炎癥因子的釋放，引起血管內皮細胞、平滑肌細胞及炎癥細胞的增殖和遷移，導致管腔狹窄，引發病理性血管重塑［13］。研究發現，黃芩素、梔子苷均可以通過抑制AP-1的轉錄活性，抑制炎癥因子（如IL-6、TNF-α、NO 等）的表達，發揮抗炎的作用［14-15］；在腸系膜動脈中發現，AngⅡ可以刺激平滑肌細胞中c-fos mRNA 表達，介導平滑肌細胞在高血壓中的增殖及遷移作用［16］；MCP-1 是最關鍵的趨化因子之一，能夠誘導單核／巨噬細胞浸潤至受損的血管壁，促進VSMC 增殖和遷移，引發血管局部炎癥反應，損傷血管；在RNAI 干擾技術沉默MCP-1 表達的小膠質細胞中，TNF-α，IL-1β 和IL-6 的表達降低，減弱了神經元損傷［17］。據研究顯示，小鼠MCP-1 基因啟動子區的調控序列主要存在于-2600～-1 bp，包括NF-κB、AP-1 等多種轉錄因子的結合位點；血管內皮細胞能夠增強AP-1 與MCP-1基因啟動區結合活性，誘導其產生MCP-1［18-19］。本研究發現，與正常對照組比較，模型組大鼠腸系膜動脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達增加，推測在高血壓狀態下，激活了AP-1 及其與MCP-1 的結合活性，誘導了炎癥反應，損傷了血管。與模型組大鼠比較，復方七芍降壓片組大鼠腸系膜動脈中AP-1、MCP-1 的蛋白表達降低。

在動脈粥樣硬化和心肌炎相關實驗中發現，脂肪分化相關蛋白、IL-17 分別可以誘導巨噬細胞、心肌細胞中AP-1、MCP-1 蛋白高表達，促進炎癥水平，給予AP-1 抑制劑后，MCP-1 蛋白表達、炎癥水平降低［5-6］。復方七芍降壓片降低血壓的機制可能為通過抑制腸系膜動脈中AP-1 活化，在轉錄水平抑制MCP-1 的蛋白表達，降低炎癥因子水平。今后將運用AP-1、MCP-1 受體沉默技術干預SHR 大鼠，探究在2 種受體沉默時它對SHR 大鼠血壓及炎癥因子的影響。