補腎中藥對老齡小鼠骨髓脂質過氧化與氧化應激損傷的影響

王翰宇黃啟明羅 斌蔡俊笙程志安?

［1.湖北中醫藥大學附屬襄陽市中醫醫院骨科，湖北 襄陽 441000；2.怡諾博（北京） 生物醫學技術有限公司，北京 100088；3.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510405；4.廣州中醫藥大學第二附屬醫院／廣東省中醫院二沙島醫院骨科，廣東 廣州 510105］

隨著年齡增大，由于脂質代謝異常和骨髓成骨能力下降造成的骨質疏松成為困擾老年人的常見疾病，特別是絕經后婦女雌激素水平下降，導致骨生成和骨吸收的代謝失衡［1］。在老化過程中，脂質過氧化在骨骼中的水平顯著增高，脂質過氧化過程中，脂氧酶（如Alox15）與多不飽和脂肪酸形成的產物結合并激活過氧化物酶體增殖劑激活受體，形成4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE），增加骨組織活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生［2］。一旦4-HNE 積累達到一定濃度，將對細胞產生毒性、基因誘變性以及致癌作用［3］。

近年來應用干細胞在臨床上治療骨科疾病、心腦血管疾病和神經系統疾病等方面的研究已取得較大進展［4-6］。干細胞良好的成骨和成脂分化潛能，以及分泌細胞因子與外泌體是其移植修復組織缺損成功的關鍵，如骨髓來源間充質干細胞、臍帶來源間充質干細胞和神經干細胞等，但其在脂質過氧化及其引起對細胞的氧化應激損傷還未研究過。

C57BL／6（B6）小鼠在3～6 個月齡為成熟成年，在10～14 個月齡為中年，在18～24 個月齡為老齡［7］。本研究分別取不同月齡的小鼠，擬通過脂肪干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）對其骨髓脂質過氧化及其氧化應激損傷的影響，并以補腎中藥作為對照，分析其對老齡小鼠骨髓細胞脂質過氧化產物4-HNE、氧應激過程中產生的自由基ROS 及凋亡水平進行檢測，為臨床老齡骨質疏松患者組織缺損的修復奠定理論基礎。

1 材料

1.1 動物 6、10、15、19 月個齡雌性C57BL／6（B6）小鼠，由廣東省醫學實驗動物中心提供與飼養，使用許可證號SYXK（粵）2013-0094，并通過廣東省中醫院實驗動物倫理委員會對動物實驗研究的審查，編號為2017035。動物飼養室溫度控制在（22±3）℃，相對濕度為（50±20）%，燈光每天控制12 h 開燈／12 h 黑暗循環。動物飼料符合動物的營養標準。飲水不限制。

1.2 藥物與試劑 金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山萸肉、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8∶4∶4∶4∶3∶3∶1∶1比例組成；健骨二仙丸由龜版、鹿角膠、黨參、枸杞子、續斷、山藥按1∶1∶3∶3∶6∶6 比例組成，以上飲片均購自廣東省中醫院藥學部，并經廣州中醫藥大學第二臨床醫學院黃永明主任醫師鑒定為正品，符合《中國藥典》規范，常規法水煎各方藥，濃縮水煎液后進行小鼠灌胃給藥。α-MEM 培養基（美國Gibco 公司，批號12571063）；青霉素與鏈霉素（美國Gibco 公司，批號10378016）；淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，批號20180902）；胎牛血清（美國 Gibco 公司，批號1992275）；CD90-FITC（美國 Biolegend 公司，批號328107）；CD105-PE（美國Biolegend 公司，批號323205）；CD73-FITC（美國Biolegend 公司，批號344015）；CD44-PE（美國Biolegend 公司，批號338807）；CD34-PerCP（美國Biolegend 公司，批號 343519）；CD29-PerCP（美國Biolegend 公司，批號303023）；CD45-APC（美國Biolegend公司，批號304011）；HLA-DR-APC（美國Biolegend 公司，批號307609）；4-HNE ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-EL-H2340c）；活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號S0033）；Annexin V-FITC 凋亡試劑盒（日本同仁化學，貨號AD10）。

1.3 儀器 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；熒光酶標儀（美國BioTek 公司）；離心機（美國Sigma 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 脂肪干細胞培養與表型分析 采取健康正常人大腿脂肪20 mL（與其簽署知情同意書，承諾用于科研），用1 倍體積的1×PBS（pH 7.4）洗滌3 次，去除油脂后加入0.2%膠原酶I 消化4 h，振蕩30 min／次，加入1 倍體積的1×PBS洗滌2 次，獲得的細胞沉淀用含10%胎牛血清的α-MEM 培養液接種于塑料材質的25 cm2培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。48 h 后換液去除未貼壁細胞，以后每3 d 換液，待細胞生長至90%時消化、傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀檢測細胞表型，誘導成骨和成脂分化鑒定脂肪干細胞。

取1.5×106個第5 代脂肪干細胞，分3 組進行染色，第1 組為CD90-FITC、CD44-PE、CD34-PerCP 和CD45-APC，第2 組為CD73-FITC、CD105-PE、CD29-PerCP 和HLA-DR-APC，第3 組同型對照為IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PerCP 和IgG1-APC，流式細胞儀上機檢測細胞表型。

2.2 脂肪干細胞誘導成骨和成脂分化 取1.0×104／mL 第5 代脂肪干細胞接種于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2培養箱中連續培養2 d，將細胞換成完全成骨誘導培養基，每3～4 d換液，培養21 d，將細胞固定進行茜素紅染色鑒定。

取1.0×104／mL 第5 代脂肪干細胞接種于6 孔板中，在37 ℃、5%CO2培養箱中連續培養2 d，將細胞換成完全成脂誘導培養基，每3～4 d 換液，進行培養14 d，將細胞固定進行油紅O 染色鑒定。

2.3 雌性C57BL／6（B6）小鼠實驗分組 將6、10、15、19 個月齡雌性C57BL／6（B6）小鼠隨機分為健骨二仙丸組（5 只）、金匱腎氣丸組（5 只）、脂肪干細胞組（5 只）與正常對照組（3 只）。健骨二仙丸組小鼠按照體質量進行給藥，給藥量為10 mL／kg，灌胃給藥，1 次／d，生藥濃度為3.45 g／mL，連續4 周；金匱腎氣丸組小鼠按照體質量進行給藥，給藥量為15 mL／kg，灌胃給藥，1 次／d，濃度為0.84 生藥g／mL，連續4 周；脂肪干細胞小鼠移植量細胞1×106／kg，0.2 mL 尾靜脈注射，1 次／周，共4 次；正常對照組小鼠灌胃，1 次／d，共4 周。

2.4 ELISA 法測定4-HNE 水平 取新鮮的骨髓細胞懸液（1×106／mL），加入1.4 mmol／L 含蛋白酶抑制劑的2-巰基乙醇混合物，在液氮和室溫中反復凍融3～5 次，離心，確定可溶解性蛋白。離心后上清液加入96 孔板中，按照產品說明書進行檢測，450 nm 波長下測定OD，計算小鼠4-HNE 水平。

2.5 檢測骨髓細胞內ROS 水平 取新鮮分離的骨髓細胞（2×106／mL）用無血清培養基洗滌細胞2 次，將細胞分別重懸于10 μmol／L DCFH-DA 中，37 ℃避光孵育60 min，每3～5 min 顛倒混勻一下，使細胞和探針充分接觸；無血清培養基洗滌細胞3 次以充分去除未結合的探針，重懸細胞，流式細胞儀檢測熒光強度，以未裝載熒光探針的正常細胞作為對照。將染色后的細胞重懸后，取100 μL 細胞懸液加到96 孔板中，通過熒光酶標儀檢測其熒光強度，計算出ROS 的相對量。

2.6 流式細胞儀法檢測骨髓細胞凋亡 取新鮮分離的骨髓細胞（0.5×106／mL）用無血清培養基洗滌細胞2 次，加入1×PBS（pH 7.4）重懸，進行Annexin V-FITC 和PI 進行染色，4 ℃冰箱孵育30 min 后，用1×PBS 洗滌2 次，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

2.7 統計學分析 應用SPSS 21.0 統計軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 脂肪干細胞表型鑒定 脂肪干細胞經體外培養后呈梭性上皮樣生長，傳代培養到第5 代鑒定細胞表型。其表達的CD90 為99.92%，CD44 為99.39%，CD73 為99.11%，CD105 為99.12%（圖1），CD34、CD29、CD45 和HLA-DR均小于2%以下，表明培養的脂肪干細胞符合間充質干細胞表型特征。

3.2 脂肪干細胞誘導成骨和成脂分化 脂肪干細胞成骨誘導14 d 后，細胞表面出現沉積鈣鹽，形成鈣結節，經茜素紅染色后呈橘紅色鈣結節，表明脂肪干細胞可以誘導成骨分化。脂肪干細胞成骨誘導7 d 后，累積脂質，脂滴變大并合并呈串珠狀，經油紅O 染色呈鮮紅色，表明脂肪干細胞可以誘導成脂分化。見圖2。

圖2 脂肪干細胞分化潛能染色（×10）

3.3 骨髓細胞4-HNE 水平 隨著小鼠月齡增大，正常對照組4-HNE 水平呈現逐漸上升的趨勢，而脂肪干細胞組呈現下降趨勢。與正常對照組比較，脂肪干細胞組10、15、19個月齡小鼠4-HNE 水平下降（P＜0.01）；與脂肪干細胞組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組4-HNE 水平上升（P＜0.05，P＜0.01），與正常對照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組和脂肪干細胞組19 個月齡老年小鼠骨髓細胞。4-HNE 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表1。

3.4 骨髓細胞ROS 水平 細胞流式結果顯示，正常對照組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從17.73% 上升到53.92%；健骨二仙丸灌胃組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從7.57%上升到32.69%；金匱腎氣丸灌胃組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從5.88%上升到32.20%；脂肪干細胞移植組中隨著小鼠月齡逐漸增大，ROS 水平從6.80%上升到24.04%，見圖4～7。

圖3 各組不同月齡小鼠4-HNE 水平

表1 各組19 個月齡老年小鼠骨髓細胞4-HNE、ROS 水平（±s，n＝5）

表1 各組19 個月齡老年小鼠骨髓細胞4-HNE、ROS 水平（±s，n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖4 正常對照組在不同月齡小鼠中骨髓細胞ROS 流式細胞圖

圖5 健骨二仙丸灌胃后在不同月齡小鼠中ROS 流式細胞圖

圖6 金匱腎氣丸灌胃后在不同月齡小鼠中ROS 流式細胞圖

圖7 脂肪干細胞組在不同月齡小鼠中ROS 流式細胞圖

與正常對照組比較，脂肪干細胞組10、15、19 個月齡小鼠骨組織中ROS 水平降低（P＜0.05）；與脂肪干細胞組比較，健骨二仙丸組和金匱腎氣丸組ROS 水平上升（P＜0.05，P＜0.01），見圖8。其中，19 月齡老年小鼠骨髓細胞，與正常對照組相比，金匱腎氣丸組ROS 水平下降（P＜0.01），見表1。

圖8 各組小鼠ROS 熒光酶標儀熒光強度

3.5 骨髓細胞凋亡 健骨二仙丸、金匱腎氣丸與脂肪干細胞移植均抑制了骨髓細胞凋亡，見圖9～12。與正常對照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細胞組在不同月齡小鼠骨髓細胞凋亡率均下降（P＜0.05），見表2。

表2 不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡率（%，±s，n＝5）

表2 不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡率（%，±s，n＝5）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

4 討論

人口老齡化加速導致我國骨質疏松及骨折發病率逐年上升，老化不僅使機體整體內環境發生巨大改變，也使骨髓內微環境與復雜的細胞內外信號調控發生變化。機體衰老造成內環境氧化應激水平逐漸增高，抗氧化應急能力降低，導致骨質量下降，骨皮質變薄，骨髓脂肪組織增多［8］。

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激（如輻射、缺血、缺氧等）時，體內自由基產生過多，不能有效及時地被抗氧化系統清除，導致氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷［9］。氧化應激過程中產生的自由基包括ROS，如活性成分攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化，會產生一系列復雜產物和新的自由基，4-HNE 即為脂質過氧化過程中最具代表性的醛基產物［10］。

4-HNE 是一種含氧αβ 不飽和醛，來源于ω-6 多不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸）的脂質過氧化過程，是此過程中產生的最主要的一種醛類。正常情況下，4-HNE 在機體的細胞或組織內維持在極低的生理濃度，當機體受到刺激發生氧化應激后水平顯著增高，在肝細胞、腎小管細胞、心臟和小腸等組織中得到證實［11］，此外，研究發現人體血漿中4-HNE 水平隨年齡增長而逐漸升高，且輕度認知障礙患者大腦組織中的其水平較同齡健康人顯著增多［12］，但有關骨髓中其作用機制研究還甚少。本研究通過不同月齡小鼠，包括成熟成年、中年和老年，研究其4-HNE 水平對ROS 水平的影響，以及所引起的細胞凋亡現象，以探究脂肪干細胞移植和補腎中藥灌胃對這一過程的改善作用，抑制4-HNE誘導的脂質過氧化以及ROS 激發的氧化應激損傷。

圖9 正常對照組在不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡流式圖

圖10 健骨二仙丸組在不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡流式圖

圖11 金匱腎氣丸組在不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡流式圖

圖12 脂肪干細胞移植組在不同月齡小鼠中骨髓細胞凋亡流式圖

實驗培養獲得第5 代脂肪干細胞，具有符合標準要求的細胞表型和成骨與成脂分化能力。19 個月齡小鼠中，與正常對照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細胞組抑制4-HNE、ROS 水平（P＜0.05，P＜0.01）；在不同月齡小鼠中，與正常對照組比較，健骨二仙丸組、金匱腎氣丸組、脂肪干細胞組抑制骨髓細胞凋亡率（P＜0.05）。

骨髓內微環境改變使具有多向分化潛能的骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）功能發生改變，細胞形態改變、增殖與分化潛能減退、老化細胞增多、端粒長度變短、端粒酶活性降低、以及成骨活性喪失等［13］。就成骨與成脂肪潛能而言，老化使MSCs 更趨向于分化為脂肪細胞而不是成骨細胞。隨著年齡的增加，MSCs 分化為成骨細胞數量的減少和成骨能力的減弱，骨量持續性地減少和丟失，導致骨質疏松及其骨折［14］。與老化相關的MSCs 增殖活性，分化能力、成骨以及成脂肪分化潛能和方向的改變，一方面涉及老化所致的細胞自身內在因素改變，另一方面涉及細胞外骨髓內微環境的改變。

補腎中藥能促進MSCs 成骨細胞分化并增加其成骨活性，調控成骨相關轉錄因子的表達，雖然不能誘導MSCs 的成骨細胞分化，但對MSCs 定向成骨細胞分化具有促進作用，并能提高其分化后的成骨活性［15］。結合氧化應激與老化的關系，補腎中藥可提高抗氧化應激能力與抑制MSCs 衰老，從而控制老化所導致的骨髓脂質氧化和氧化應急。

本研究結果表明，針對老齡小鼠，補腎中藥灌胃和脂肪干細胞移植均可以抑制骨髓細胞4-HNE 水平，抑制ROS水平；從而抑制老齡小鼠骨髓細胞凋亡率，且脂肪干細胞移植對骨髓脂質過氧化和氧化應激損傷作用更為顯著。