強骨膠囊對去勢后小鼠骨質疏松性骨折愈合的影響

笪巍偉唐德志金鎮雄趙永見馬 勇施 杞王擁軍

（1.上海中醫藥大學脊柱病研究所，上海 200032；2.揚州市中醫院骨傷科，江蘇 揚州 225000；3.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032；4.揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225000）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是最為常見的原發性骨質疏松癥之一，更年期婦女作為高危人群發病率可達25%～50%［1］，且隨年齡增長而呈現出上升趨勢，由于其發病隱匿，伴有骨痛、駝背等癥狀，潛在的脊柱及髖部等部位骨折風險高于男性，因此，中老年婦女的健康、經濟、生活等方面均受到嚴重威脅［2］。骨質疏松性骨折在圍手術期或傳統治療的同時，均需積極聯合原發病的干預。藥物是最為常用的有效方法，國內中成藥繁多，其中強骨膠囊是目前臨床上常用于原發性骨質疏松癥及骨質疏松性骨折防治的中藥二類新藥，并被世界衛生組織（WHO）推薦為代表性中成藥［3］，具有補腎、強骨、止痛之功。本研究旨在分析強骨膠囊在骨質疏松性骨折治療中的效果，為該藥臨床運用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 3 月齡C57BL／6 雌鼠36 只，清潔級，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK（京）2012-0001［4］，20～25 ℃，12 h 光照，相對濕度為40%～70%。依據上海中醫藥大學倫理委員會規定進行動物研究。

1.2 試劑與藥物 強骨膠囊（北京岐黃醫藥股份有限公司，國藥準字Z20030007）主要成分為骨碎補總黃酮，每粒膠囊0.25 g，內容物為棕紅色至棕褐色粉末，取適量加入蒸餾水制成對應濃度混懸液。蘇木精-伊紅（南京建成科技有限公司）；Alcian Blue 8GX、Eosin Y、Orange G、Phloxine B、萘酚AS-BI 磷酸溶液、sodium iodate 碘酸鈉均購自美國Sigma 公司。

1.3 儀器 TPP2020 組織脫水機（德國Leica 公司）；VS120-SL 全片組織掃描儀（日本Olympus 公司）；EG1160全自動石蠟包埋機（德國Leica 公司）；uCT80 Micro-CT（瑞士Scanco Medical 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 36 只小鼠隨機區組法分為生理鹽水組、強骨膠囊組（0.107 g／kg），每組18 只，第7、14、28 天各6 只。建立去勢后小鼠復合脛骨骨折模型［4］，術后24 h 胃內給藥，分別予給強骨膠囊、生理鹽水灌胃，并按照3 個時間點進行影像學及病理組織學觀察［4］。

2.2 血清雌二醇（estradiol，E2）檢測放射免疫法檢測［4］。

2.3 影像學檢測 uCT80 Micro-CT 對左側脛骨進行X-ray掃描、三維重建及形態計量學分析［4］。

2.4 病理組織學染色 HE、ABH／OG 染色，具體方法見文獻［4］。

2.5 統計學分析 采用SPASS 18.0 軟件進行分析計量資料以（±s）表示，兩組間的比較使用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 強骨膠囊對小鼠血清E2 水平的影響 28 d 后，強骨膠囊組E2 水平高于生理鹽水組（P＜0.01），說明強骨膠囊能夠增加去勢后雌激素水平，改善去勢后骨量丟失的進展，見表1。

表1 強骨膠囊干預28 d 對小鼠血清E2 水平的影響（±s）

表1 強骨膠囊干預28 d 對小鼠血清E2 水平的影響（±s）

注：與生理鹽水組比較，??P＜0.01。

3.2 強骨膠囊促進斷端愈合的影像學變化

3.2.1 2 組骨折愈合過程的X-Ray 表現 給藥7 d，2 組骨折斷端無明顯差異；給藥14 d，生理鹽水組骨折斷端骨痂影稀少，強骨膠囊組可見大量骨痂影，越過斷端；給藥28 d，生理鹽水組骨折部位尚未完全愈合，斷端模糊，強骨膠囊組骨折斷端已愈合，連續性完好，見圖1。骨痂Micro-CT 三維重建圖顯示，強骨膠囊組3 個時間點的骨痂體積、骨小梁數量及骨折愈合的完整性均優于生理鹽水組，見圖2，提示強骨膠囊能夠有效促進損傷部位骨痂的形成和重塑，加速骨折愈合。

圖1 骨折X-Ray 變化

圖2 不同時間點骨痂三維重建

3.2.2 骨痂Micro-CT 定量分析 給藥7 d，與生理鹽水組比較，強骨膠囊組可提高骨痂的骨小梁連接密度（Conn.D.）（P＜0.01）；給藥14 d，與生理鹽水組比較，強骨膠囊組骨痂中骨小梁體積比（BV／TV）和骨密度BMD（TV）增加（P＜0.05）；給藥28 d，強骨膠囊組總骨組織密度BMD（BV），以及骨折愈合部位的剛度、彈性模量均高于生理鹽水組（P＜0.05），見表2～5。因此，強骨膠囊有利于增加骨痂及骨組織的密度，改善骨折愈合后的力學性能。

3.3 強骨膠囊促進斷端愈合的HE／ABHO 染色觀察

3.3.1 HE 染色 強骨膠囊組7、14 d 時可促進斷端部位骨痂的大量形成、重塑，28 d 時多余的骨痂組織被重吸收，骨髓腔再通，骨折部位愈合后連續性完好，而生理鹽水組3 個時間點骨折斷端愈合的進程明顯滯后于強骨膠囊組，見圖3。

表2 干預7 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表2 干預7 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，??P＜0.01。

表3 干預14 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表3 干預14 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

表4 干預28 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

表4 干預28 d 脛骨骨痂Micro-CT（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

表5 干預28 d 脛骨骨折部位生物力學（±s）

表5 干預28 d 脛骨骨折部位生物力學（±s）

注：與生理鹽水組比較，?P＜0.05。

圖3 干預7、14、28 d 脛骨骨折部位HE 染色

3.3.2 ABHO 染色 強骨膠囊組7 d 時骨折部位可見大量軟骨細胞增殖，細胞活性明顯優于生理鹽水組；14 d 時，強骨膠囊組骨痂中軟骨細胞逐漸凋亡，而成骨細胞不斷增加；28 d 時，強骨膠囊組成骨細胞在殘留的鈣化軟骨基質上形成新的骨組織，使斷端愈合、連續，骨髓腔再通，而生理鹽水組骨痂中仍有較多骨小梁存在，排列雜亂，見圖4。

圖4 干預7、14、28 d 脛骨骨折部位ABHO 染色

4 討論

女性月經終止后，卵巢雌激素分泌減少是導致其早期骨質流失的根本原因，導致骨保護作用及維生素D 活性降低［5］，5～10 年骨量年丟失率約3%～5%；由于骨吸收大于骨形成，骨小梁連續性中斷，皮質骨變薄且多孔，從而易誘發骨質疏松性骨折［6］。

骨質疏松性骨折的愈合過程通常包括纖維、軟骨及骨性骨痂期［7］。骨痂的形成機制對臨床骨折愈合至關重要，反映了骨組織再生修復的自然規律［8］，軟骨痂具有較大的黏彈性，是骨痂調控的黃金階段，內含大量成骨干細胞及成骨因子，研究認為軟骨內成骨遲緩、骨折愈合質量低下是骨質疏松性骨折愈合的重要特征［9］。本實驗中影像學結果可見生理鹽水組骨痂的形成、發展及骨折線的消失明顯滯后于強骨膠囊組；病理學染色顯示生理鹽水組小鼠7 d時骨折斷端附近軟骨細胞數目稀少，軟骨痂形成不足；14 d時生理鹽水組骨痂內小梁稀疏，軟骨細胞較少，強骨膠囊組軟骨細胞逐漸凋亡，成骨細胞增加，且小梁致密；28 d 時生理鹽水組骨髓腔未再通，仍有部分骨痂存在，且內部骨小梁排列紊亂，而強骨膠囊組骨髓腔再通，皮質連續。

進一步通過Micro-CT 定量分析，發現強骨膠囊可顯著提高早中期骨痂形成的體積、骨小梁連接密度及骨痂密度；后期2 組差異不明顯，認為可能由于強骨膠囊組在14～28 d期間，硬骨痂吸收、重塑，骨折斷端已愈合，而生理鹽水組28 d 時斷端周圍仍有部分硬骨痂存在，導致Micro-CT 定量分析2 組差異不明顯。而有限元分析提示強骨膠囊能夠明顯增加骨折后期（28 d）愈合部位的剛度和彈性模量，最大受力強度也有所提高，促進其生物力學性能的恢復。

骨質疏松性骨折多歸類于《黃帝內經》 中“骨痹”“骨痿”等范疇［10］。中醫學認為“腎主骨，生髓藏精”，更年期階段女性“天癸絕”，腎精逐漸衰少、骨髓生化乏源，骨骼失以充養而導致骨痿［11］。《內經》 記載：“骨痿者，補腎法治之”的論述，因此，補腎法是中醫治療PMOP 的基本大法。對“腎-骨-骨髓”間生理關系的研究，發現補腎中藥能夠促進骨髓間充干細胞分化為成骨細胞，調節骨的生長和修復［12］。骨碎補具有補腎、續傷、壯骨等功效，其提取物骨碎補總黃酮，作為強骨膠囊的主要成分［13］，被廣泛用于骨質疏松［14］、脆性骨折、肢體關節及腰背疼痛等治療［15］。研究［16］表明骨碎補能夠促進骨形成、抑制骨吸收增加骨密度，其作用機制可能包括促進OPG 在成骨細胞中的表達，下調RANKL 和RANK 表達，并抑制破骨細胞活性［17-18］；促使去勢后血清破骨細胞及其前體細胞分化刺激因子減少，如白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等，而升高白細胞介素4（IL-4）等［19］；降低血漿黏度，改善骨折斷端部位的血運，增加BMP-2 及IGF-1 水平，促進軟骨、成骨細胞的增殖分化［20］；減輕血清瘦素（LEP）對骨組織受體β2-腎上腺素受體（ADRB2）的激活效果，從而下調去勢后大鼠IL-6 和前列腺素E2（PGE2）的表達，抑制骨吸收［21］；下調血清組織蛋白酶K mRNA 的表達，抑制破骨細胞的骨吸收，增加骨強度［22］；提高骨髓腔中成骨細胞的代謝型谷氨酸（GLU）受體-5 的表達，調節骨組織細胞的生理活性和分化成熟等細胞進程［23］；上調核結合因子a1（cbfa1）表達的水平，促進骨髓間質干細胞成骨分化［24］。

本實驗僅從影像學和病理組織學分析了強骨膠囊促進去勢后小鼠骨質疏松性骨折愈合的功能，尚需對其可能的作用機制進一步深入研究。