龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎的影響

陳文錦，吳昔鈞，華 臻，張亞峰

（南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214001）

秦艽是我國重要的傳統(tǒng)中藥之一，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛之功效，臨床上常用于風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)半身不遂、骨節(jié)酸痛等病癥。秦艽主要含裂環(huán)烯醚萜苷、甾醇苷、揮發(fā)油和糖類等成分，而龍膽苦苷是裂環(huán)烯醚萜苷中的主要有效成分［1-2］，且有學(xué)者［3］發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷經(jīng)腸道菌群代謝后的產(chǎn)物龍膽堿，與龍膽苦苷相似，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用［4］。楊肖鋒等［5］發(fā)現(xiàn)龍膽堿是龍膽苦苷發(fā)揮抗炎藥效的重要活性代謝物。目前國內(nèi)尚無較深入的采用龍膽堿干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎的研究報道，故本研究應(yīng)用膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探究龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥的影響。

1 材料

1.1 動物 清潔級雌性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（200±10）g，由無錫市血吸蟲病防治研究所動物實驗中心提供，使用許可證號SYXK（蘇）2012-0034；24 h 新生雌性SD 大鼠6只，由上海西普爾-必凱公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2008-0016。實驗方案通過南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥物 龍膽堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號171241-200501）。雙氯芬酸鈉腸溶片（北京諾華制藥有限公司，批號2016051020）。木瓜蛋白酶（美國Sigma 公司，批號110203）；IL-1β 大鼠ELISA 試劑盒（武漢伊艾博生物科技有限公司，批號081M00623V）；IL-6 大鼠ELISA 試劑盒（武漢伊艾博生物科技有限公司，批號081M00717V）；TNF-α 大鼠ELISA 試劑盒（武漢伊艾博生物科技有限公司，批號081M00422V）；DMSO（美國Sigma公司，批號BCBP4417V）。

1.3 儀器 HERAcell BB15 型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；UV-3000 紫外分光光度計（日本島津公司）；550酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；VCX130PB 超聲粉碎儀（美國Sonics 公司）；BX-43 顯微鏡（日本Olympus 公司）；YLS-7C 足趾容積測定儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 取24 h 新生雌性SD 大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)［6］，將穩(wěn)定傳代的軟骨細(xì)胞分為正常組、模型組（LPS 8 μg／mL）、龍膽堿組（LPS 8 μg／mL+龍膽堿100 μmol／L）。

2.2 MTT 檢測 原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞按上述分組方法以1×104／孔接種至96 孔，培養(yǎng)24 h。模型組和龍膽堿組加入含對應(yīng)濃度試劑和藥物的培養(yǎng)基，正常組加入等體積的PBS，孵育 24 h，每孔加入新鮮配制的 MTT 溶液（5 mg／mL）20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后丟棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，淡紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀在570 nm 波長下測量各孔OD，并計算細(xì)胞存活率。

2.3 膝骨關(guān)節(jié)炎模型制備及分組 50 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、雙氯芬酸鈉組（5 mg／kg）、龍膽堿（20 mg／kg）組、龍膽堿（40 mg／kg）組。除正常組外，其余各組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射含4% 木瓜蛋白酶的生理鹽水（0.25 mL／kg），注射1 次／7 d，共3 次。造模成功后，雙氯芬酸鈉組（5 mg／kg）、龍膽堿（20 mg／kg）組、龍膽堿（40 mg／kg）組大鼠分別給予相應(yīng)藥物灌胃，正常組和模型組給予相應(yīng)體積劑量的生理鹽水灌胃，1 次／d，共21 d。

2.4 足跖腫脹體積測定 各組大鼠給藥前及給藥后的第7、14、21 天，排水法測定右足的足跖腫脹體積。

2.5 ELISA 檢測 按照ELISA 試劑盒說明書中的操作步驟對大鼠血清及關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α水平進(jìn)行測定。

2.6 大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE 染色 給藥周期結(jié)束后，各組大鼠麻醉并取右側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，以10%中性福爾馬林固定24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切成5 μm 薄片，脫蠟復(fù)水后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，再次脫水并透明封片后，在光鏡下拍照，并評估滑膜組織的病理變化。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Graph Pad Prism 7.0 軟件進(jìn)行作圖，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間的比較使用t檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍膽堿對軟骨細(xì)胞存活率的影響 MTT 結(jié)果顯示，正常組、模型組軟骨細(xì)胞存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；給予龍膽堿干預(yù)后，軟骨細(xì)胞存活率上升（P＜0.01）。見表1。

表1 龍膽堿對軟骨細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝6）

表1 龍膽堿對軟骨細(xì)胞存活率的影響（±s，n＝6）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.2 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹的影響 未給藥干預(yù)前，與正常組比較，造模后各組大鼠右足跖腫脹體積增加（P＜0.01）。給藥干預(yù)1 周后，與模型組比較，龍膽堿（40 mg／kg）組及雙氯芬酸鈉組大鼠的足跖腫脹體積降低（P＜0.01）；干預(yù)2、3 周后，模型組大鼠足跖腫脹持續(xù)加重，而給藥組的大鼠足跖腫脹有不同程度地降低（P＜0.01），表明龍膽堿可顯著減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的足跖腫脹，見圖1。

圖1 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠足跖腫脹的影響

3.3 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜損傷的影響 正常組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨完整，無明顯剝離及壞死，滑膜細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤，無明顯充血及水腫；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨可見局灶性壞死，滑膜表層細(xì)胞增生明顯，呈“柵欄”狀排列，炎性細(xì)胞顯著浸潤，滑膜血管充血、水腫，可見肉芽組織形成并伴有纖維化；龍膽堿及雙氯芬酸鈉干預(yù)后，與模型組相比，滑膜腫脹、充血程度及滑膜細(xì)胞增生均有所減輕；在雙氯芬酸鈉組中，未觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤和纖維化；在龍膽堿給藥組中，可見明顯少于模型組的炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE 染色（×200）

3.4 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)液中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響 與正常組比較，膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)液中 IL-6、IL-1β、TNF-α 的水平升高（P＜0.01）；龍膽堿及雙氯芬酸鈉腸溶片干預(yù)后，以上炎癥因子在血清和關(guān)節(jié)液中的水平均降低（P＜0.01）。見圖3～4。

圖3 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清炎癥因子水平的影響

圖4 龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)液中炎癥因子水平的影響

4 討論

傳統(tǒng)中藥秦艽具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛之功效，臨床上具有廣泛的應(yīng)用［7-12］。龍膽苦苷是秦艽的主要活性成分，其可以促進(jìn)胃排空及腸蠕動［13］，具有一定的抗炎［14］、鎮(zhèn)痛［15］、保肝［16］等作用，而楊肖鋒等［5］研究表明，龍膽苦苷在人體內(nèi)被腸道菌群作用后會迅速降解為龍膽堿。龍膽堿具有解熱［3］、鎮(zhèn)靜催眠［17］、抗驚厥［18］等作用。王英等［19］發(fā)現(xiàn)龍膽堿與龍膽苦苷有相似的藥理作用，而匡海學(xué)等［4］認(rèn)為，龍膽苦苷發(fā)揮藥效作用可能與其轉(zhuǎn)化成龍膽堿的作用有關(guān)。雖然關(guān)于龍膽苦苷與龍膽堿藥效的研究報道較多，但未見學(xué)者研究龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎的抗炎作用，本研究首次對龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用進(jìn)行了實驗，闡明了龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎的抗炎作用。

本研究中，首先應(yīng)用LPS 誘導(dǎo)原代軟骨細(xì)胞建立軟骨細(xì)胞炎癥模型，觀察龍膽堿對處于炎癥的軟骨細(xì)胞是否有保護(hù)作用。結(jié)果表明，龍膽堿對處于炎癥環(huán)境的軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究應(yīng)用木瓜蛋白酶注射入大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，并應(yīng)用龍膽堿進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎的抗炎作用。結(jié)果顯示，龍膽堿能顯著抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的足跖腫脹，減輕膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的炎癥，并能顯著降低膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)液中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的水平。本研究的結(jié)果說明，龍膽堿對膝骨關(guān)節(jié)炎具有抗炎作用，這與一些學(xué)者的研究結(jié)果一致［20］。龍膽堿作為中藥秦艽主要成分龍膽苦苷的代謝物，本研究結(jié)果可能為臨床上應(yīng)用傳統(tǒng)中藥秦艽治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供了一定理論支持。

本研究雖然表明龍膽堿可能是治療膝骨關(guān)節(jié)炎的新的有效物質(zhì)，但龍膽堿通過何種途徑發(fā)揮其抗炎作用的目前尚不清楚。研究［21］已發(fā)現(xiàn)，龍膽堿可以通過抑制Rho／ROCK／NF-κB 信號通路、增加TGF-β／ smad-3 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗炎的作用。同時龍膽堿作為經(jīng)典中藥復(fù)方獨活寄生湯的有效成分，還發(fā)現(xiàn)其抑制了NLRP3／NFκB 信號通路［22］。但龍膽堿在膝骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮抗炎作用的具體機(jī)制仍未可知，上述報道僅僅揭示了龍膽堿對這些炎癥相關(guān)信號的影響，但其抗炎作用具體是通過何種確切的機(jī)制產(chǎn)生的仍未可知，因此未來的研究中應(yīng)進(jìn)一步探究龍膽堿的抗炎作用機(jī)制。