天地鎮(zhèn)顫方顆粒劑、口腔速溶散抗帕金森病的比較藥理學(xué)研究

夏 鵬趙生玉文 雯高麗娟付 穎韓 麗徐世軍?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病藥物整合轉(zhuǎn)化研究所，四川成都 611137）

藥物劑型與藥效密切相關(guān)［1］，因此合理的選擇藥物制劑形態(tài)是確保成藥療效的重要環(huán)節(jié)。口腔速溶散是一種口腔黏膜給藥的新劑型，由藥物與3 種水溶性輔料混合制備成的超微口腔速溶粉末。藥物在口腔內(nèi)遇唾液可迅速溶散混懸呈流體，經(jīng)口腔黏膜、舌下及消化道快速吸收而提高了藥物生物利用度［2］，相較其它口服給藥劑型（如顆粒劑、片劑、膠囊等）具有吸收多、生物利用度較高、服用方便、順應(yīng)性高等優(yōu)點(diǎn)，在老年人群用藥和順應(yīng)性不足的患者中具有優(yōu)勢(shì)。天地鎮(zhèn)顫方是由天麻、熟地黃、全蝎組成的抗帕金森病（Parkinson's disease，PD）的專利處方（201711205034.4），為了篩選確定該方合適的制劑劑型，本研究采用比較藥理學(xué)的研究思路，在3 種擬PD 動(dòng)物模型上比較顆粒劑和口腔速溶散藥效學(xué)的異同。

1 材料

1.1 藥物 天地鎮(zhèn)顫顆粒劑（20180619）、口腔速溶散（批號(hào)20180731），均購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑與炮制系；美多巴（批號(hào)SH3580）購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司。

1.2 動(dòng)物 KM 雄性小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào)51203500 005873；C57BL／6 雄性小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，合格證號(hào)51203500006753，均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）-2015-030。

1.3 試劑 氫溴酸檳榔堿（南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)170502S）；氧化震顫素（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)033M4724V）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)S0 620 A）；抗酪氨酸羥化酶（TH）抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)GR3219792-1）；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20180922、20190316）和丙二醛（MDA，批號(hào)20180922、20190316）測(cè)試盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 ZZ-6 型自主活動(dòng)測(cè)試儀（成都泰盟科技有限公司）；OFT-100 型大小鼠開場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；BA400Digital 型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；SYFM-8II 型振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)（濟(jì)南倍力公司）；HX-200 高速中藥粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）。

2 方法

2.1 藥物制備 口腔速溶散：采用振動(dòng)磨將主藥物研磨至5～20 μm；乳糖粉、葡萄糖粉混合研磨成粒徑為0.3～5 μm的粉末，與薄荷油、木糖醇混合研磨至0.2～3 μm，將上述兩部分粉末在振動(dòng)磨中1∶1 混勻，即得。

顆粒劑：天麻以70 ℃、40% 乙醇提取，低溫減壓濃縮，噴霧干燥，得到干燥粉；藥渣以水提取，低溫減壓濃縮，得到稠浸膏；熟地以70% 乙醇提取，低溫減壓濃縮，得到稠浸膏；全蝎以中藥粉碎機(jī)粉碎，粉末全部通過5 號(hào)篩，95%通過6 號(hào)篩，最后合并上述藥物，濕法制粒，干燥，整粒，即得。

2.2 造模、分組及給藥

2.2.1 氫溴酸檳榔堿致震顫模型 50 只KM 小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組、氫溴酸檳榔堿組、美多巴組（50 mg／kg）、天地鎮(zhèn)顫顆粒組（2.70 g／kg）、天地鎮(zhèn)顫口腔速溶散組（2.70 g／kg），每組10 只。除空白對(duì)照組和氫溴酸檳榔堿組小鼠灌胃給予生理鹽水外，其余各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，1 次／d，給藥體積為10 mL／kg，連續(xù)14 d。末次給藥1 h 后，除空白對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠腹腔注射氫溴酸檳榔堿（25 mg／kg）溶液造模［3-4］，給藥體積為10 mL／kg。

2.2.2 氧化震顫素致震顫模型 除造模用藥換為氧化震顫素（0.15 mg／kg）［3-4］外，其余分組、給藥方法均同“2.2.1”項(xiàng)。

2.2.3 MPTP 致PD 模型 52 只C57BL／6 小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白對(duì)照組、MPTP 組、美多巴組（50 mg／kg）、天地鎮(zhèn)顫顆粒組（2.70 g／kg）和口腔速溶散組（2.70 g／kg），除空白對(duì)照組8 只小鼠外，其余每組均為11只。除空白對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其他各組小鼠腹腔注射新鮮配置的MPTP（30 mg／kg）生理鹽水［5］，1 次／d，給藥體積為10 mL／kg，連續(xù)7 d。第8 天開始除空白對(duì)照組及MPTP 組小鼠灌胃給予生理鹽水外，其余各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，1 次／d，給藥體積為10 mL／kg，連續(xù)14 d。

2.3 行為學(xué)檢測(cè) 氫溴酸檳榔堿致震顫實(shí)驗(yàn)：末次給藥1 h后，除空白對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠腹腔注射氫溴酸檳榔堿，記錄小鼠震顫潛伏期（腹腔注射氫溴酸檳榔堿后到出現(xiàn)肌肉震顫的時(shí)間）及震顫持續(xù)時(shí)間（出現(xiàn)肌肉震顫到肌肉震顫消失的時(shí)間）。氧化震顫素致震顫實(shí)驗(yàn)：除造模藥換為氧化震顫素外，行為學(xué)測(cè)試方法同氫溴酸檳榔堿致震顫實(shí)驗(yàn)。MPTP 致PD 實(shí)驗(yàn)：末次給藥1 h 后，自主活動(dòng)記錄儀記錄小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)，開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄小鼠5 min 內(nèi)的運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)總距離，最后記錄小鼠由頭朝上放于頂端小球至頭朝下爬下小球至桿的時(shí)間（T1）及由桿頂端至爬向桿底部的時(shí)間（T2）。

2.4 MDA、SOD 水平測(cè)定 氫溴酸檳榔堿及氧化震顫素致震顫實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測(cè)試后，快速處死小鼠，冰浴無菌快速分離黑質(zhì)和紋狀體，采用試劑盒檢測(cè)MDA、SOD 水平。MPTP 致帕金森模型動(dòng)物爬桿實(shí)驗(yàn)后，快速處死小鼠，取腦組織勻漿檢測(cè)MDA、SOD 水平。

2.5 TH 免疫組化 實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)取4 只小鼠，冰浴無菌快速取腦，分離黑質(zhì)，4%多聚甲醛固定，用于多巴胺神經(jīng)元的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 2 種劑型對(duì)氫溴酸檳榔堿致震顫模型小鼠影響的比較

3.1.1 小鼠震顫行為學(xué) 如圖1 所示，與氫溴酸檳榔堿組比較，2 種劑型均可一定程度延長(zhǎng)模型小鼠震顫潛伏期，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)顆粒劑可以縮短小鼠震顫持續(xù)時(shí)間（P＜0.05）。

圖1 2 種劑型對(duì)氫溴酸檳榔堿致震顫小鼠震顫行為學(xué)的影響

3.1.2 黑質(zhì)和紋狀體MDA、SOD 水平 如圖2 所示，與空白對(duì)照組比較，氫溴酸檳榔堿組小鼠黑質(zhì)MDA、SOD 水平無明顯變化（P＞0.05），但紋狀體MDA 水平增高、SOD水平降低（P＜0.05）；與氫溴酸檳榔堿組比較，2 種劑型降低小鼠紋狀體MDA 水平（P＜0.05），同時(shí)口腔速溶散亦能增加模型小鼠紋狀體SOD 水平（P＜0.05）。

圖2 2 種劑型對(duì)氫溴酸檳榔堿致震顫小鼠黑質(zhì)和紋狀體MDA、SOD 水平的影響

3.2 2 種劑型對(duì)氧化震顫素致震顫模型小鼠影響的比較

3.2.1 小鼠震顫行為學(xué) 如圖3 所示，與氧化震顫素組比較，顆粒劑能延長(zhǎng)模型小鼠的震顫潛伏期，縮短震顫持續(xù)時(shí)間（P＜0.05）。臨床相同劑量下，顆粒劑延長(zhǎng)震顫潛伏期顯著優(yōu)于口腔速溶散（P＜0.05）。

圖3 2 種劑型對(duì)氧化震顫素致PD 模型小鼠震顫行為學(xué)的影響

圖4 2 種劑型對(duì)氧化震顫素致震顫小鼠黑質(zhì)和紋狀體MDA、SOD 水平的影響

3.2.2 黑質(zhì)和紋狀體MDA、SOD 水平 如圖4 所示，與氧化震顫素組比較，2 種劑型對(duì)小鼠黑質(zhì)MDA、SOD 水平均無影響（P＞0.05），但顆粒劑可降低模型小鼠紋狀體MDA水平，增加SOD 水平（P＜0.05），而口腔速溶散僅可增加紋狀體SOD 水平（P＜0.05）。臨床相同劑量下，2 種劑型比較，顆粒劑降低MDA 水低于口腔速溶散（P＜0.05），但SOD 水平高于口腔速溶散（P＜0.05）。

3.3 2 種劑型對(duì)MPTP 致PD 模型小鼠影響的比較

3.3.1 小鼠自主活動(dòng) 如圖5 所示，與空白對(duì)照組比較，MPTP 組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)均減少（P＜0.05）；與MPTP 組比較，2 種劑型均能夠提高模型小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)（P＜0.05）。臨床相同劑量下，2 種劑型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 2 種劑型對(duì)MPTP 致PD 小鼠自主活動(dòng)的影響

3.3.2 開場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 如圖6 所示，與空白對(duì)照組比較，MPTP 組小鼠開場(chǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間及運(yùn)動(dòng)距離減少（P＜0.01）；與MPTP 組比較，2 種劑型均能夠提高模型小鼠的開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)總距離（P＜0.05，P＜0.01）。臨床相同劑量下，2 種劑型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 2 種劑型對(duì)MPTP 致PD 小鼠開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

3.3.3 爬桿實(shí)驗(yàn) 如圖7 所示，與空白對(duì)照組比較，MPTP 組小鼠T1、T2 均延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01）；與MPTP組比較，口腔速溶能夠縮短TI、T2（P＜0.05），顆粒劑對(duì)兩者T1、T2 無影響（P＞0.05）。臨床相同劑量下，2 種劑型對(duì)T1、T2 的影響比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 2 種劑型對(duì)MPTP 致PD 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的影響

3.3.4 腦MDA、SOD 水平 如圖8 所示，與空白對(duì)照組比較，MPTP 組小鼠腦內(nèi)MDA 水平增高，SOD 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；與MPTP 組比較，2 種劑型均能夠降低小鼠腦內(nèi)MDA 水平，并增加SOD 水平（P＜0.05，P＜0.01）。臨床相同劑量下，2 種劑型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 2 種劑型對(duì)MPTP 致PD 小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

3.3.5 對(duì)黑質(zhì)TH 神經(jīng)元陽(yáng)性表達(dá)影響 如圖9 所示，與空白對(duì)照組比較，MPTP 組小鼠黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元大面積死亡，形態(tài)受損嚴(yán)重（細(xì)胞核固縮嚴(yán)重，碎裂），陽(yáng)性染色顯著變淡，陽(yáng)性染色神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與MPTP 組比較，天地鎮(zhèn)顫顆粒和口腔速溶散組存活細(xì)胞增多，正常形態(tài)神經(jīng)元增高，陽(yáng)性染色增強(qiáng)，存活神經(jīng)元數(shù)目增高（P＜0.05）。雖然2 種劑型之間存活神經(jīng)元數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但口腔速溶散組存活多巴胺神經(jīng)元的形態(tài)較顆粒劑完整，核固縮、碎裂細(xì)胞較少。

圖9 黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元TH 免疫組化

4 討論

震顫和運(yùn)動(dòng)障礙是PD 主要臨床特征，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元損傷導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺（dopamine，DA）低下是其發(fā)病根本原因［5］，補(bǔ)充腦內(nèi)DA 的左旋多巴替代療法［6］是當(dāng)前臨床常用干預(yù)措施，但不能減緩甚至阻止患者黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性過程。氧化應(yīng)激損傷是PD 公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制之一［7］，因此研發(fā)既能改善臨床癥狀和保護(hù)多巴胺神經(jīng)元、又能抗氧化應(yīng)激損傷的藥物是PD 干預(yù)藥物的重要方向。顆粒劑和口腔速溶散都是經(jīng)消化道給藥的劑型，雖然顆粒劑載藥量大，藥物穩(wěn)定性較高［8］，但對(duì)PD 患者而言順應(yīng)性較差；口腔速溶散分散程度高，溶解度高，藥物除與顆粒劑相同的胃腸吸收外，口腔快速溶散后可口腔黏膜、舌下黏膜和舌下靜脈等途徑吸收，吸收途徑多，生物利用度相對(duì)較高。為了比較天地鎮(zhèn)顫方2 種劑型的優(yōu)劣，本實(shí)驗(yàn)采用了氫溴酸檳榔堿和氧化震顫素?fù)p傷膽堿能神經(jīng)的震顫模型，以及MPTP 損傷多巴胺神經(jīng)所導(dǎo)致的PD 模型，進(jìn)行了比較藥理學(xué)研究。

氫溴酸檳榔堿及氧化震顫素均為膽堿能神經(jīng)激動(dòng)劑，乙酰膽堿（ACH）的生理作用與DA 相反，正常生理狀態(tài)下2 種遞質(zhì)在腦內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡［9］，帕金森病抗膽堿藥物主要通過抑制ACH 活性，提高DA 效應(yīng)［10］發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，天地鎮(zhèn)顫顆粒劑和口腔速溶散均能改善2 種模型的震顫行為異常，提高紋狀體SOD 水平，降低MDA 水平，但顆粒劑較口腔速溶散為優(yōu)。MPTP 為一種神經(jīng)毒素，能特異性地進(jìn)入多巴胺神經(jīng)元并產(chǎn)生神經(jīng)毒性［11］，損害多巴胺神經(jīng)元，導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生明顯的運(yùn)動(dòng)障礙、伴隨抑郁行為［12］。天地鎮(zhèn)顫顆粒劑、口腔速溶散均可使小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)及站立次數(shù)明顯增多、開場(chǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間及距離增加，提示2 種劑型均能夠減輕模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，抑郁癥狀，但口腔速溶散能縮短模型小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)T1、T2，具有提高運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的作用；2 種劑型均可降低腦MDA 水平并提高SOD 水平，并能保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受損傷，抗氧化應(yīng)激作用相似，但口腔速溶散對(duì)多巴胺神經(jīng)元保護(hù)作用更為顯著。綜上可見，顆粒劑在通過膽堿能神經(jīng)保護(hù)改善帕金森病具有優(yōu)勢(shì)，但口腔速溶散在保護(hù)多巴胺神經(jīng)、抗氧化應(yīng)激損傷和改善運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面優(yōu)于顆粒劑，同時(shí)考慮其多途徑吸收提高生物利用度、服用方便增強(qiáng)順應(yīng)性的特點(diǎn)，可以作為天地鎮(zhèn)顫方制劑成型工藝的優(yōu)選方案。