基于網絡藥理學探究參麥注射液抗肺癌的扶正-祛邪機制

楊從影，易劍峰，包 梅，張秀美

（宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000）

參麥注射液源自明代秦景明《癥因脈治》 所載之參冬飲，由中藥紅參、麥冬提純精制而成［1］。古方以紅參為君，甘溫滋補、益氣生津；麥冬為臣，甘寒清熱、養(yǎng)陰止渴，一君一臣、一溫一寒相互配伍，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈的功效［2-3］，而參麥注射液不僅具有古方功效，更具有抗腫瘤、抗休克、提高免疫力、強心擴管、抗心肌缺血、去除氧自由基等現代藥理作用［4］。研究［5-6］表明，紅參主要藥效成分為人參皂苷，有增強機體自身免疫、抗氧化和抗腫瘤效果；麥冬［7-8］有效成分主要為甾體皂苷和高異黃酮，有抗腫瘤、抗衰老、保護心血管系統(tǒng)、增強免疫力等藥理作用。早期研究［9］發(fā)現，參麥注射液主要有抗心衰、抗心律失常等治療心血管系統(tǒng)疾病的藥理作用；近年來不少學者［10-12］發(fā)現，它對體內外Lewis 肺癌、肉瘤S180、肝癌H22 等實體瘤均有顯著的抗腫瘤作用；徐泳等［13］一項Meta 分析顯示，參麥注射液聯(lián)合含鉑一線化療藥物治療非小細胞肺癌，可增加抗腫瘤療效，提高患者生活質量；朱亞蘭等［14］研究表明，參麥注射液輔助化療能提高肺癌等惡性腫瘤臨床療效。

盡管參麥注射液治療肺癌效果突出，但其具體的生物分子機制仍鮮有報道。隨著網絡藥理學［15］概念的應運而生，生物信息學、計算機網絡技術、分子虛擬研究等手段的不斷進步，可為研究中成藥多成分、多靶標、多途徑的藥理機制提供了新的思路。本研究采用網絡藥理學技術，運用文獻檢索、分子在線模擬找靶、基因本體論分析、KEGG 通路富集分析等手段，對參麥注射液抗肺癌生物分子藥理機制進行網絡分析，為明確其提供理論線索。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件 （1）ChemicalBook 數據庫（https：／／www.chemicalbook.net）；（2）SIB 分子構效相似性靶標預測服務器（http：／／www.swissparam.org）；（3）Stitch 化學成分-基因相互作用預測數據庫（http：／／stitch.embl.com）；（4）GeneCards 基因數據庫、DisGeNET 疾病-基因關聯(lián)數據庫；（5）String 基因-蛋白質互作網絡數據庫（https：／／stringdb.com）；（6）ClueGO 基因本體論富集分析插件；（7）DAVID v6.8 生物信息學分析平臺（https：／／DAVID.ncifcrf.gov／）；（8）Cytoscape 網絡處理軟件；（9）R 語言繪圖工具。

1.2 參麥注射液成分的選擇 在CNKI 數據庫檢索關鍵詞“參麥”“參麥注射液”“成分”，將通過高效液相色譜及超高效、液質聯(lián)用等檢測參麥注射液成分的文章納入，并從中挖掘主要藥效成分。利用Chemical Book 數據庫統(tǒng)一核對名稱、CAS 號，創(chuàng)建mol2 格式文檔保存。

1.3 參麥注射液靶標集合的構建 （1）將參麥注射液有效成分mol 格式文檔導入SIB 分子構效相似性靶標預測服務器，預測其潛在靶標；（2）利用Stitch 數據庫挖掘參麥注射液有效成分的潛在靶標，參數設置為“l(fā)ow confidence 0.15；No more 20 interactors”。將2 種來源的靶標建立交集，構建參麥注射液靶標集合。

1.4 肺癌相關靶點集合的構建 本研究利用Gene Cards、Dis Ge NET 兩大基因-疾病關聯(lián)數據庫尋找與肺癌密切相關靶點。以“Lung Neoplasms”為檢索詞，按照相關度分數排序的方法，提取3 個數據庫與肺癌相關的前100 個靶點，建立交集，構建肺癌靶點集合。

1.5 參麥注射液靶點-肺癌靶點關聯(lián)網絡的構建 將參麥注射液靶基因與肺癌靶點導入String 數據庫，背景設置為“Homo sapiens”構建參麥靶點-肺癌靶點關聯(lián)網絡，將結果導入Cytoscape 網絡處理軟件，利用“NetworkAnalyzer”插件分析該網絡中心性靶標參數。“度值（Degree）”“介數（Betweenness）”“最短距離（Closeness）”是分析網絡中心性的3 個最關鍵參數，度值、介數、最短路徑越大，節(jié)點在該網絡就越重要［16］。

本研究依據2 個原則選取參麥注射液抗肺癌靶點，（1）直接抗癌靶點，參麥注射液基因與肺癌基因共同的靶點，即參麥注射液靶點與肺癌靶點的交集；（2）間接抗癌靶點（網絡中心靶點），以度值、介數、最短路徑中心性的平均值為“臨界值”，取“參麥靶靶點-肺癌靶點關聯(lián)網絡”中“臨界值”以上的參麥注射液靶點。這些靶點起到了溝通參麥注射液和肺癌的樞紐作用，是參麥注射液調控肺癌的間接關鍵靶標。

1.6 GO 分析 GO 分析包括細胞組分、分子功能、生物過程3 個部分，其中生物過程最能體現靶基因的藥理特性，故本研究利用Clue GO 插件對參麥注射液抗肺癌靶基因進行GO 生物過程富集分析，探究其潛在藥理作用。設置參數：定義來源為“Homo sapiens”，P≤0.05，Interval Min Level＝2，Max Level＝5。

1.7 KEGG 通路分析 將參麥注射液抗肺癌靶基因導入DAVID v 6.8 服務器，對其進行KEGG 通路富集分析，篩選出P＜0.05 的癌癥通路，并運用R 語言繪圖分類，研究參麥注射液抗肺癌通路。

2 結果

2.1 參麥注射液主要活性成分 初檢得到有關文獻70 篇，其中符合“1.2”項下納入標準的有9 篇［7，17-24］，見表1。

通過檢索文獻，高效、超高效液相技術檢測到參麥注射液主要含有多種皂苷類藥效成分，其中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1，麥冬皂苷D，甲基麥冬二氫黃酮A、B 等9 種活性成分是其主要活性成分，能較好的代表參麥注射液進行下一步研究。故將其統(tǒng)一保存為mol2 格式文件，進行網絡分析。主要成分信息如表2 所示。

表2 參麥注射液主要活性成分

2.2 參麥注射液潛在靶標 如表3～4 所示，利用SIB 服務器、STITCH 數據庫共發(fā)現參麥注射液9 種藥效成分對應126 個潛在靶標，其中人參皂苷類成分對應的靶標數目多、藥理作用廣，可能是參麥注射液的主要藥效成分。

2.3 參麥注射液靶基因-肺癌基因網絡 如圖1 所示，在Gene Cards、DisGeNET 數據庫分別搜索相關分數排序前100 的肺癌基因，建立交集后得到肺癌相關基因161 個。將“2.2”得到的126 個參麥注射液靶基因與161 個肺癌相關基因導入String 數據庫，構建參麥注射液靶基因-肺癌基因關聯(lián)網絡。如圖2 所示，除去未發(fā)生相互作用的基因，共有260 個基因參與了關聯(lián)網絡的構建，包含5 239 條相互作用連線。全網平均度值為30.46，平均介數為3.63×10-3，平均最短距離為4.64×10-1，其中包括16 個直接抗肺癌靶點（AKT1、CASP3、CHRNA3、CHRNA7、ESR1、KIT、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MET、MMP9、NFE2L2、RB1、STAT3、STK11、VEGFA）；有18 個靶點度值、介數、最短距離均超過了平均值，為網絡中心間接抗肺癌靶點（AKT1、VEGFA、MAPK3、STAT3、ESR1、SRC、CASP3、MAPK1、CREB1、MMP9、BDNF、MAPK14、STAT1、NOS3、FYN、ABCG2、F2、MAPT）。具體見表5。

表3 SIB 服務器靶標預測結果

表4 STITCH 數據庫靶標預測結果

圖1 肺癌相關基因韋恩圖

2.4 GO 分析 如圖3～4 所示，將25 個抗肺癌關鍵靶點進行GO 分析，共涉及52 個GO 生物過程條目，176 條相互作用關系。GO 生物過程條目可分為8 類，蛋白質定位到細胞核的正調節(jié)（45.16%）、細胞對活性氧的反應（20.97%）、雌性性腺發(fā)育（14.52%）、紅細胞分化（6.45%）、卵泡分化（4.84%）、細胞對血小板源生長因子（PDGF）的反應（3.23%），細胞對神經生長因子的反應（3.23%）、腎臟發(fā)育調控（19.1%）。其中，蛋白質定位到細胞核的正調節(jié)、細胞對活性氧的反應、細胞對血小板源生長因子（PDGF）的反應、細胞對神經生長因子的反應均與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系。

2.5 KEGG 分析 如表6、圖5 所示，對25 個抗肺癌關鍵靶點進行KEGG 分析，發(fā)現參麥注射液能調控5 大類、22條與肺癌密切相關的通路，包括①腫瘤血管的形成密切相關的血管內皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導因子（HIF-1）等2 條信號通路；②腫瘤增殖相關的MAPK、PI3K／Akt、Ras、Rap1、ErbB、mTOR、ESR、FoxO 等8 條信號通路；③腫瘤浸潤轉移相關的黏著斑連接（Adherens junction）、縫隙連接（Gap junction）、黏著斑（Focal adhesion）等3條信號通路；④腫瘤免疫相關的腫瘤壞死因子、自然殺傷細胞、T 細胞受體、B 細胞受體等4 條信號通路；⑤其他與腫瘤代謝相關的腫瘤通路、非小細胞肺癌通路、腫瘤微小RNA 調控、腫瘤蛋白磷酸化、腫瘤碳代謝等5 條通路。

3 討論

圖2 參麥注射液靶基因-肺癌基因相互作用網絡

表5 主要抗癌靶點

肺癌在腫瘤相關死亡率中排名第一，具有較高的惡質性和侵襲性［25］。中藥注射液能抑制肺癌發(fā)展，提高患者自身免疫，逆轉腫瘤的耐藥性，在抗肺癌方面有獨特優(yōu)勢［26］，其中參麥注射液能緩解癌性疲勞，提高腫瘤緩解率，治療肺癌效果顯著［27］。本研究通過文獻檢索、分子相似性靶標預測、數據庫挖掘等方法，發(fā)現參麥注射液中主要含有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1以及麥冬皂苷D、甲基麥冬二氫黃酮A、B 等9 種成分，通過構建靶基因-肺癌基因關聯(lián)網絡發(fā)現它能直接、間接作用于MAPK1、CASP3、AKT1、MMP9、RB1、STAT1、VEGFA 等25 個核心靶標，發(fā)揮抗肺癌作用。朱春燕［28］發(fā)現，人參皂苷Rd能通過下調MAPK 通路、激活caspase-3 通路，抑制肺癌細胞的生長增殖；劉彩宏等［29］實驗表明，人參皂苷Rg1能抑制AKT 磷酸化，減緩細胞增殖與遷移；另有研究［30］證實，人參皂苷Rb1能濃度依賴性抑制MMP9 表達，使腫瘤細胞侵襲能力下降；藺娜等［31］發(fā)現，人參皂苷Rg1有下調VEGF、MMP9 的作用；羅林明等［32］發(fā)現，人參皂苷具有多種抗腫瘤機制，能抑制RB 磷酸化、抑制MAPK、AKT、MMP9、STAT 等基因過表達，發(fā)揮多途徑抗腫瘤作用；此外，研究［33］表明麥冬皂苷、麥冬高異黃酮是麥冬的主要抗腫瘤成分，能通過調控血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶（MMP）抑制腫瘤的轉移與發(fā)展；研究［34］發(fā)現，麥冬皂苷D 能抑制AKT 蛋白磷酸化，誘導肺癌A549細胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲與遷移。以上報道與本研究結果基本吻合，證明參麥注射液抗腫瘤成分主要為人參皂苷、麥冬皂苷、麥冬高異黃酮，能通過多靶點促進肺癌細胞凋亡、抑制肺癌的增殖與侵襲。

圖3 GO 功能注釋網絡

圖4 GO 功能注釋餅狀圖

本研究對參麥注射液25 個抗肺癌靶標進行GO 生物過程分析，發(fā)現蛋白質定位到細胞核的正調節(jié)、細胞對活性氧的反應、細胞對血小板源生長因子、細胞對神經生長因子的反應等生物過程，以上生物過程與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究［35-36］表明，神經生長因子、血小板源生長因子能促進肺癌細胞的侵襲與轉移，在肺癌新生血管生成、增殖擴散中發(fā)揮重要作用，而生長因子調控細胞增殖、遷移的主要途徑正是通過激活受體下游通路，激活定位與細胞核中相關轉錄因子，促進腫瘤的增殖發(fā)展。活性氧是與細胞凋亡相關的重要信號分子，能上調caspase 和BAX 表達、抑制BCL-2 表達，促進肺癌A549 細胞的凋亡［37］。GO生物過程提示參麥注射液可能是通過調控生長因子及其通路、活性氧途徑等分子機制，實現抗肺癌的藥理作用。

進一步對參麥注射液25 個抗肺癌靶點進行KEGG 通路富集分析，發(fā)現參麥注射液能參與調控5 大類、22 條與肺癌密切相關的通路。（1）抑制腫瘤血管生成，傅華洲等［38］利用雞胚絨毛尿囊膜實驗證明參麥注射液總皂苷能抑制癌細胞VEFG 通路表達，具有抗腫瘤血管生成作用；顧蒞冰等［39］發(fā)現麥注射液能降低移植瘤LoVo 細胞缺氧誘導因子1α（HIF-1α）的表達，抑制HIF-1 介導的血管生成信號通路，降低腫瘤組織的微血管密度，與本研究富集的抗腫瘤血管生成VEFG 通路、HIF-1 通路相符；（2）抑制腫瘤增殖，已知MAPK、PI3K／Akt、Ras、ErbB、mTOR、FoxO 等信號通路均能促進腫瘤的增殖分裂［40］，本研究發(fā)現，參麥注射液能調控以上信號通路抑制肺癌的增殖；王紅寧［41］發(fā)現人參皂苷Rb1、Re、Rg1 能影響MAPK 細胞信號，抑制白血病細胞的體外增殖；陳美娟等［42］發(fā)現麥冬皂苷D 等成分能下調PI3K-AKT-mTOR 信號通路，對非小細胞肺癌細胞株NCI-H157 體外抑制作用明顯；均說明參麥注射液有效成分能通過抑制多種促腫瘤增殖信號通路，實現抗肺癌的藥理作用；（3）抗腫瘤浸潤轉移，本研究發(fā)現參麥注射液能調控縫隙連接、黏著斑連接相關通路抗肺癌浸潤轉移。王蘇萍等［43］發(fā)現人參總皂苷能影響黑色素瘤B16 細胞縫隙連接功能，促進Cx2 等蛋白表達，抑制腫瘤的增殖；提示參麥注射液具有抗肺癌細胞浸潤轉移的作用；（4）調節(jié)腫瘤免疫功能，本研究富集結果表明，參麥注射液有調控腫瘤壞死因子（TNF）及自然殺傷細胞（NK）、T 細胞、B 細胞信號通路，調節(jié)免疫功能的作用；賈珍等［44］臨床研究發(fā)現參麥注射液能調控T 細胞亞群（CD3+、CD4+）及NK細胞，改善腫瘤患者免疫功能和生存質量；（5）其他與腫瘤代謝相關的腫瘤通路，該部分通路在以上4 類信號通路中均有體現，比如腫瘤通路、非小細胞肺癌通路正是由MAPK、VEGF、HIF-1 等信號通路交聯(lián)網絡而成。

表6 KEGG 通路

圖5 KEGG 信號通路富集

總之，本研究運用網絡藥理學對參麥注射液主要成分進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現它能通過“多成分、多靶點、多途徑”抑制肺癌的增殖發(fā)展、浸潤轉移，抑制腫瘤血管生成，實現祛邪作用；通過調節(jié)機體腫瘤免疫、腫瘤代謝，達到扶正效果。