基于網絡藥理學探討莪術抗血栓作用機制

周曙光，韋 潔，廖 欣，龐力峰，楊希霖

（1.廣西壯族自治區人民醫院，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫藥研究院，廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022）

莪術是姜科植物蓬莪術、廣西莪術或溫郁金的干燥根莖，性辛、溫，味苦，歸肝、脾經，具有行氣破血、消積止痛的功效，臨床上多用于治療血滯經閉腹痛。近幾年，多項藥理研究指出莪術活性成分具有抗炎、抗腫瘤等作用［1-3］；課題組前期發現，莪術不同溶劑提取部位均具有抗血栓作用［4-5］，但具體機制仍未知，本研究將從網絡藥理學角度探究其抗血栓的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 莪術化學成分篩選 本研究利用中藥系統藥理學平臺（TCMSP）（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）檢索莪術的所有化學成分，共搜集了81 個化合物。鑒于莪術油活性成分具有明確的抗血栓作用［6］，為充分考慮莪術藥物特性和優勢，避免藥效成分信息遺漏，本研究設置口服生物利用度（OB≥25%）和類藥性（DL≥0.06）為篩選閾值，獲得34 個化合物作為莪術活性成分。

1.2 莪術活性成分候選靶點篩選 利用TCMSP 和BATMANTCM 平臺，對34 個化合物的潛在靶標進行預測，其中TCMSP平臺優選Drug Bank 已驗證靶點，BATMAN-TCM 平臺優選Score≥40 的靶點，采用藥物相似性比對原理，將所收集靶點匯總去冗余，即為藥物預測靶點。

1.3 血栓疾病基因收集 利用 DrugBank、OMIM、DisGeNET 數據庫獲取血栓相關的疾病基因，將所收集基因靶點去冗余，即為血栓靶點。

1.4 藥物活性成分-靶點網絡的構建與分析 將莪術活性成分-靶點網絡文件導入Cytoscape3.5.1 軟件，通過Network Analyzer 工具分析網絡節點，獲取對應拓撲度值（degree），以≥2 倍degree 的中位數為篩選條件，獲取莪術活性成分作用的潛在關鍵靶點。

1.5 藥物活性成分-靶點-疾病相互作用網絡的構建與分析 獲得莪術成分對應靶點和疾病靶點信息后，利用String軟件構建藥物靶點-疾病的蛋白互作網絡（PPI），再利用Cytoscape3.5.1 軟件構建藥物活性成分-靶點-疾病網絡，提取網絡中的交集部分，即為莪術抗血栓關鍵靶點。

1.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數據庫工具和Cytoscape ClueGo 插件分別對上述關鍵靶點／基因進行KEGG 通路富集分析和GO 分析，獲得莪術治療血栓相關疾病的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

2 結果

2.1 莪術的活性化學成分 通過OB≥25%和DL≥0.06 篩選獲得34 個化合物，見表1。

2.2 莪術活性化學成分-靶點網絡構建 從TCMSP 數據庫（Drug Bank 已驗證靶點）和BATMAN-TCM 數據庫（Score≥40）中，獲取上述34 個化合物的預測靶點。其中有5 個成分，姜黃酮、Wenjine、三環萜、（4S，5S）-（+）-吉馬酮4，5-環氧化物、雙去甲氧基姜黃素，無符合篩選條件的對應靶點，故舍棄。利用Cytoscape 3.5.1 構建莪術活性成分-靶點網絡，如圖1 所示，莪術29 個主要活性成分的靶點（去冗余）共計81 個。在該成分-靶點網絡中，靶點網絡節點的degree 中位數為3，選取degree≥6 的節點作為莪術活性成分的關鍵作用靶點，共計17 個，在圖中為成分靶點集合內圈。該17 個作用靶點分別與27 個藥物活性成分發生相互作用，如表2 所示。

2.3 藥物成分-靶點-疾病網絡構建 Drug Bank、OMIM 和DisGeNET 數據庫中以“Thrombosis”為關鍵詞搜索血栓相關疾病及靶點，獲得61 個疾病基因。將活性成分靶點-血栓靶點網絡文件導入Cytoscape 3.5.1，構建莪術活性成分靶點-血栓靶點網絡（圖2），提取靶點交集部分靶點共20個（表3），作為莪術活性成分抗血栓關鍵靶點，并制作蛋白互作（PPI）網絡（圖3）和活性成分-血栓靶點網絡（圖4），網絡的拓撲結構參數如表4 所示。

表1 莪術主要活性化學成分

圖1 莪術活性成分-靶點網絡

2.4 莪術抗血栓關鍵靶點的KEGG 分析和GO 分析 取上述關鍵靶點，利用DAVID 數據庫進行KEGG 分析。KEGG富集結果顯示，符合P＜0.05 的富集信號主要涉及凝血反應（Complement and coagulation cascades，Platelet activation）、神經活性配體受體反應（Neuroactive ligand-receptor interaction）、腎素分泌（Renin secretion）、脂肪細胞脂肪分解（Regulation of lipolysis in adipocytes）等，見表5。

表2 關鍵靶點及對應的藥物成分

圖2 藥物活性成分靶點-血栓靶點網絡

表3 莪術抗血栓關鍵靶點

利用Clue GO 插件，將莪術抗血栓關鍵靶點導入Cytoscape 3.5.1，篩選P≤0.05 的富集信號，獲取莪術抗血栓機制的生物學過程（Biological Process，BP）相關條目共計30 項，涉及cGMP 信號、凝血通路、蛋白激活通路、腺苷受體信號通路、血小板相關受體信號通路等，見圖5～6。

圖4 莪術活性成分-血栓靶點網絡

表4 莪術抗血栓關鍵靶點拓撲參數

表5 莪術抗血栓關鍵靶點KEGG 富集信號通路

圖5 莪術抗血栓關鍵靶點的GO 富集分析結果

圖6 莪術抗血栓關鍵靶點的生物學功能注釋

3 討論

中藥由于成分多樣而出現“一藥多效”，近幾年來網絡藥理學的快速發展為其作用機制研究提供了新手段。它能夠將藥物作用網絡與生物網絡整合在一起，通過網絡特征分析快速高效地篩選中藥有效成分，分析成分之間可能的相互作用，并探討藥物成分的潛在作用靶點及發揮的生物學效應，簡化了藥效物質基礎及作用機制的發現過程［7-8］。

課題組前期研究表明，莪術不同溶劑提取物具有抗血栓效果，然而具體作用機制不明。本研究通過網絡藥理學預測，莪術中有29 種活性成分，莪術二酮、β-欖香烯、吉馬酮、姜黃酮等，可能通過作用于凝血通路（靶點為F2、F3、F9、F7、F10、FGA、PROC、PROS1、TFPI）、血小板聚集通路（靶點為FGA、PTGIR、PTGS1）干預凝血級聯反應和血小板激活聚集過程，從而發揮抗血栓作用。

F10（凝血因子X）和F2（凝血因子II）是外內源性凝血反應的核心酶，介導凝血酶原的轉化和凝血酶的形成，聯合上游F3（凝血因子III）、F7（凝血因子VII）和F9（凝血因子IX）等內外源性凝血關鍵因子，對最終的凝血過程和血栓形成具有決定性影響［9］。FGA 是由肝臟合成的纖維蛋白前體，能在內源凝血因子或外源組織因子作用下生成纖維蛋白，參與機體凝血過程［10］。蛋白C（PROC）和蛋白S（PROS1）是機體蛋白C 抗凝系統的重要組成部分，其中PROC 在血漿中為無活性的酶原形式，可被凝血酶活化為APC，PROS1 可協同APC 水解滅活部分活化的凝血因子（FVa、FVIIIa），減緩內源性凝血速度［11］。

多項研究［5，12］表明，莪術可通過影響花生四烯酸代謝產物的生成，如6-keto-PGF1α（PGI2 代謝產物）和TXB2（TXA2 代謝產物），進而發揮抗血栓作用。本研究所預測的關鍵靶點和信號通路，血小板激活通路（platelet activation）及其關鍵靶點（FGA、PTGIR、PTGS1）與上述抗血栓機制關聯性較大，共有6 種化合物參與了該通路，且目前并未發現莪術相關物質對這幾個相關靶點的研究報道。其中上述靶點分別編碼纖維蛋白原（Fg）、前列環素PGI2受體（IP）和環氧合酶1（COX1）3 種蛋白，IP 和COX1參與花生四烯酸代謝，影響花生四烯酸及代謝產物誘導的血小板聚集和血栓形成［13］。

此外，經過活性篩選的莪術成分，共有5 種化合物可能與F2（凝血因子II）產生相互作用，鑒于F2 在凝血途徑中處于下游關鍵環節，同時也參與了血小板活化過程，F2 也是莪術多成分發揮抗血栓作用的關鍵靶點。

莪術二酮、β-欖香烯、吉馬酮等屬于莪術油活性成分，姜黃酮屬于姜黃素類成分，莪術油成分和姜黃素類成分的抗血栓作用在多項研究中也得到了證實，更佐證了該網絡藥理學預測方法的可行性［14-15］。