UPLC-Q-TOF／MS 法坤怡寧顆?；瘜W成分分析

趙桂鈴繆興龍宋兆輝高 雯周桂榮?李 萍?

（1.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 210009；2.天士力控股集團有限公司研究院現代中藥開發中心，天津 300410；3.天士力制藥集團股份有限公司創新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410）

坤怡寧顆粒由地黃、黃芪、淫羊藿等7 味藥材組成。該方用來治療圍絕經期綜合征［1］，是臨床經驗處方，以滋腎養陰、平肝寧心為治療原則。目前針對坤怡寧顆粒的物質基礎研究鮮有報道，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術對坤怡寧顆粒的化學成分進行全面分析，發現115 種化學成分，并鑒定出109 種，主要包括酚類、黃酮類、單萜苷類等，以期為坤怡寧顆粒的藥效物質基礎和質量控制研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜（Waters ACQUITY UPLC，包括二元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、PDA檢測器、Empower 2 工作站）、Masslynx 色譜工作站（美國Waters 公司）；Waters Q-TOF Premier 質譜儀（英國Waters MS Technologies 公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；粉碎機（德國IKA 公司）；Milli-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）；KQ-500DV 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸（1110831-201204）、芒柄花素（111703-201504）、綠原酸（110753-201415）、梓醇（110808-201009）、兒茶素（110877-2011203）、毛蕊花糖苷（111530-201007）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（111920-201304）、黃芪甲苷（110781-201616）、檸檬酸（111679-200401）、淫羊藿苷（110737-201516）、金絲桃苷（111521-201507）、異槲皮苷（111809-201403）、芍藥苷（110736-201539）、仙茅苷（110771-201506）、寶藿苷Ⅰ（111852-201102）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；朝藿定B（AM775E）、朝藿定C（AM776E）、箭藿苷B（AW412S）、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷Ⅲ對照品購自天津一方科技有限公司；隱綠原酸（20140811）對照品購自天津士蘭科技有限公司；毛蕊異黃酮（DST171108-012）、寶藿苷VII（DST180508-084）、黃芪皂苷Ⅰ（DST170516-016）、異黃芪皂苷Ⅰ（DST180315-022）、朝藿定A1（DST180109-064）對照品購自成都德思特生物技術有限公司；黃芪異黃烷苷（16043004）對照品購自成都普瑞法科技有限公司；各單味藥材及坤怡寧顆粒由天士力研究院提供。甲酸、乙腈（質譜純）及甲醇（色譜純）（德國Merck 公司）；純凈水（吉林娃哈哈食品有限公司）；超純水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1.0 min，97% A；1.0～8.0 min，97%～90% A；8.0～9.0 min，90% A；9.0～12.0 min，90%～87% A；12.0～15.0 min，87%～85% A；15.0～25.0 min，85%～76% A；25.0～31.0 min，76%～69% A；31.0～32.0 min，69%～65% A；32.0～34.0 min，65%～60% A；34.0～36.0 min，60%～50% A；36.0～38.0 min，50% A～0；38.0～40.0 min，0～97% A）；體積流量0.3 mL／min；檢測波長270 nm；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），MSE掃描正負離子模式檢測，掃描范圍m／z50～1 200，亮氨酸腦啡肽為校正液，進行實時校正。毛細管電壓負離子模式2.3 kV，正離子模式2.8 kV；錐孔電壓40 V；霧化氣為高純度氮氣，體積流量50 L／h；碰撞氣為氬氣；脫溶劑氣體積流量800 L／h，溫度350 ℃；離子源溫度120 ℃。高能量掃描時，離子阱為20～60 eV。

2.2 對照品溶液制備 精密稱定各對照品適量于量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，甲醇定容至刻度，即得。

2.3 供試品溶液制備 取坤怡寧顆粒及各單味藥材粉末0.5 g，精密移取25 mL 50% 甲醇于錐形瓶中，超聲提取15 min，50%甲醇補足減失質量，14 100 r／min 離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

3 結果與分析

采用UPLC-Q-TOF-MS 對供試品及對照品溶液進行正、負離子全掃描，獲得BPI 圖，共標定了115 個色譜峰，見圖1～2。通過與對照品比對、數據庫匹配分析及查閱文獻，從中發現115 個化合物，鑒定了109 個，包括13 個酚類、6 個木脂素類、43 個黃酮類、7 個三萜皂苷類、25 個單萜苷類、11 個苯丙素類、4 個其他類，見表1。

圖1 坤怡寧顆粒UPLC-TOF-MS 正離子模式下BPI 圖

圖2 坤怡寧顆粒UPLC-TOF-MS 負離子模式下BPI 圖

3.1 酚類 在復方中共檢測到13 個酚類化合物，在正離子模式下響應較好。峰61 的一級正離子給出m／z489.137 2 ［M+Na］+的準離子峰，二級質譜以母離子失去葡萄糖殘基（162 Da）產生m／z327.067 3 的碎片離子，該碎片離子再斷鍵，得到m／z205.046 9 ［M+Na-Glc-C7H6O2］+和m／z123.055 1 ［C7H7O2］+的碎片離子。經與對照品、文獻［7］比對，鑒定61 號峰為仙茅苷，見圖3。

圖3 仙茅苷正離子模式下質譜圖及裂解規律

3.2 木脂素類 從坤怡寧顆粒中共鑒定出6 種木脂素類成分，其母核結構有雙四氫呋喃型木脂素、苯代四氫萘型等，峰45 的一級質譜圖見圖4。準分子離子峰m／z897.300 1［M+Na］+，其二級碎片離子有m／z765.258 0 ［M+Na-Api］+，m／z735.243 2 ［M+Na-Glc］+，m／z603.205 1 ［M+Na-Api-Glc］+，m／z441.156 4 ［M+Na-Api-2Glc］+和m／z317.091 1 ［Glc+Api+Na］+，通過文獻［14］，推斷45 號峰為（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-芹糖-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖基-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表1 坤怡寧顆粒化學成分歸屬

續表1

續表1

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圖4 （-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-芹糖-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖基-4＇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷正離子模式下質譜圖及裂解規律

3.3 黃酮類 黃酮類化合物在負離子模式下響應值較高，在復方中共檢測到43 個，其苷元類型主要為黃酮醇類、黃烷醇類、異黃酮類等。黃酮苷類在ESI-MS 軟電離條件下，可以獲得非常強的分子離子峰，在二級質譜中，易失去糖基形成苷元離子。在負離子模式下，峰84 給出明顯的分子離子m／z721.236 5 ［M+COOH］-，二級質譜以母離子失去葡萄糖殘基（162 Da）產生m／z513.178 1 的碎片離子；母離子失去鼠李糖殘基（146 Da）產生m／z529.170 6 的碎片離子；m／z409.125 9 是母離子失去3 位鼠李糖后，葡萄糖部分環裂（-C4H8O4）生成的；母離子在失去葡萄糖殘基的基礎上再脫去鼠李糖殘基（146 Da）產生m／z367.118 6的碎片離子，裂解途徑見圖5。此裂解規律與文獻［10］一致，經對照品比對，鑒定為淫羊藿苷。

圖5 淫羊藿苷負離子模式下一級質譜圖及裂解規律

3.4 單萜類 共鑒定25 個單萜類化合物，主要分為單環單萜類、雙環單萜類及環烯醚萜類。該類成分主要來自赤芍、地黃兩味藥材。

3.4.1 雙環單萜類 已鑒定14 個雙環單萜苷類化合物，包括氧化芍藥苷及其異構體、芍藥內酯苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷及其異構體等，該類成分來自赤芍。高能碰撞易失去苯甲酸（BA）而形成［M-H-122］-和m／z121 ［BA-H］-的特征離子，還易形 成 ［M-HCH2O］-、［M-H-Glu-BA］-等特征離子。38 號峰的一級質譜圖中給出了明顯的分子離子峰m／z525.160 9 ［M+COOH］-和m／z479.155 0 ［M-H］-，二級碎片信息有m／z449.144 6［M-H-CH2O］-、m／z357.121 0 ［M-H-BA］-、m／z327.107 9［M-H-CH2O-BA］-、m／z165.053 0 ［M-H-CH2O-BA-Glc］-和m／z121.028 7 ［BA-H］-，經與對照品、文獻［3］比對，確定峰38 為芍藥苷，見圖6。

圖6 芍藥苷負離子模式下質譜圖及裂解規律

3.4.2 環烯醚萜類 環烯醚萜類化合物的基本母核是環烯醚萜醇，具有環狀烯醚及半縮醛羥基，半縮醛羥基性質活潑，故該類化合物多以苷類存在［24］。本實驗中環烯醚萜苷類成分在正離子模式下響應值較高，共鑒定8 個環烯醚萜苷類化合物，其中7 個來源于地黃。其中，峰2 一級質譜有m／z385.110 8 ［M+Na］+的準離子峰，二級碎片離子有m／z355.085 6 ［M+Na-CH2OH］+、m／z223.056 9 ［M+Na-Glc］+、m／z203.053 9 ［Glc+Na］+和m／z185.016 1 ［Glc+Na-H2O］+。經與對照品、文獻［2］比對，確定峰2 為梓醇，見圖7。

圖7 梓醇正離子模式下質譜圖及裂解規律

3.5 三萜皂苷類 已鑒定三萜類化合物共7 個，正負離子均有響應，該類化合物易連續脫糖，包括黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及其異構體，來自黃芪。峰100 給出明顯的分子離子峰m／z829.457 ［M+COOH］-和m／z 793.451 5［M-H］-，二級碎片離子m／z489.357 3 ［M-H-Glc-Xyl］-為脫去1 分子葡萄糖基（m／z 162）和木糖基（m／z132）產生的。其中發現峰99 與峰100 為同分異構體，分子量相同，經與黃芪甲苷對照品、文獻［15］比對，確定峰99 為黃芪甲苷，故峰100 為黃芪皂苷Ⅲ，見圖8。

圖8 黃芪皂苷Ⅲ負離子模式下質譜圖及裂解規律

3.6 苯丙素類 從復方中鑒定了11 個苯丙素類化合物，其中包括綠原酸、新綠原酸與隱綠原酸3 個同分異構體，母離子為m／z353.085 7 ［M-H］-，二級碎片離子m／z191.053 9 為母離子丟失一分子咖啡?；跰-H-caffeoyl］-產生的，m／z179.033 0 為脫去糖得到的咖啡?；槠踓affeoyl-H］-，在此基礎上脫去一分子CO2得到m／z135.047 0 ［caffeoyl-H-CO2］-。新綠原酸、隱綠原酸的裂解規律與綠原酸相似。由于三者質譜數據相同，無法通過質譜分辨，只能通過與對照品比對，并結合文獻［6，12］數據來確定化合物，因此，峰25 經對照品比對為綠原酸，見圖9；峰28 經對照品比對為隱綠原酸，故確定峰15 為新綠原酸。

3.7 其他類化合物 其他類化合物包括生物堿類、有機酸類等。38 號峰的一級正離子給出m／z342.172 3 ［M+H］+峰，其二級碎片離子有m／z297.113 2 ［M-（CH3）2NH］+和m／z265.086 9 ［M-（CH3）2NH-CH3OH］+，且此峰來自淫羊藿藥材，與文獻［12］一致，推測32 號峰為木蘭堿。

4 討論

通過查閱文獻，收集坤怡寧顆粒各味藥材的化學成分，建立化學成分數據庫。經數據庫匹配分析、化合物精確分子量、碎片離子峰、色譜保留時間以及對照品比對，結合文獻數據來鑒定化學成分。但由于對照品的稀缺，一些同分異構體物質（如峰42、44 等），還需通過核磁等方法進一步研究來佐證。

圖9 綠原酸負離子模式下質譜圖及裂解規律

本研究運用UPLC-Q-TOF-MS 技術對坤怡寧顆粒中的化學成分進行快速分析，發現了115 種化學成分，包含酚類、黃酮類、單萜苷類等。其所含的主要成分與文獻［25-30］治療圍絕經期綜合征的藥理活性成分具有一致性，其中酚類、木脂素類、黃酮類及三萜皂苷類都有植物雌激素樣作用；而單萜苷類具有一定的神經保護、抗氧化、抗衰老及增強免疫作用。本研究對坤怡寧顆粒進行全面的化學成分分析，以期為其質量控制提供參考，同時也為其藥效物質基礎研究奠定基礎。