重金屬銅耐受突變株的高效構建方法

傅科鶴，范莉莉，李園園，熊國勇

(南昌師范學院生物系，330032，南昌)

0 引言

近幾十年來，隨著工業廢水排放及農藥的大量使用，導致土壤中銅的污染日趨嚴重，治理土壤銅污染成為普遍關注的一個問題[1-2]。傳統的治理方法如沉淀法、離子交換法、電化學法、膜分離技術等方法成本高、選擇性低、周期長，并可能產生二次污染。生物吸附能夠很好地克服上述難題而受到廣泛關注[3]。微生物由于分布廣、生長迅速、抗逆性強等優點，在修復土壤重金屬方面具有明顯優勢[4]。木霉菌是一種傳統的生防菌，具有促進植物生長、抑制土壤病原菌、分布廣泛，抗性強等特點，在生物修復方面被廣泛使用[5]。

為獲得高效修復土壤重金屬污染的木霉菌，首先要篩選高耐受菌株。只有高耐受菌株才能夠在污染土壤中繁殖，從而達到修復土壤污染的目的[6]。相比傳統方法，ATMT技術能夠更高效獲得高耐受突變株，所獲突變株不僅能夠直接應用于土壤銅污染的修復，同時還能為挖掘木霉菌吸附和代謝銅相關基因資源，揭示木霉菌-銅互作分子機理提供重要工具。農桿菌介導的轉化技術(ATMT)由于操作簡便、外源DNA結構完整、轉化機理清楚、整合位點穩定、拷貝數低及對目標基因組影響小等優點，已成為一種廣泛應用的基因轉化方法。自從1998年de Groot首次將其應用于絲狀真菌的研究后[7]，已經有50多種絲狀真菌成功通過ATMT轉化。常規ATMT轉化過程主要包括含目標質粒的農桿菌培養，與目標菌孢子共培養及抗性平板篩選。整個過程周期長，成本高(篩選過程用到的抗生素)。因此本研究通過改進轉化過程中的抗性平板篩選步驟，使轉化及篩選效率得到明顯提高。建立一種高效突變株構建方法，能有效提高土壤重金屬修復過程中菌株獲得效率；同時，該方法有利于功能基因的克隆及分析，為構建高吸附銅工程菌株提供關鍵技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 農桿菌AGL1及質粒PC1300th由本實驗改造并保存，里氏木霉菌株QM9414由浙江大學農學院章初龍副教授饋贈。

1.1.2 試劑 氨芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢霉素購自Amresco公司，分別配成100 mg/mL，0.45 μm濾膜無菌過濾，分裝成小管，-20℃凍存備用；利福平用DMSO溶解后，配制成100 mg/mL，分裝成小管，-20℃凍存備用；Cu2+由CuSO4溶解于蒸餾水中，配成10 mM母液，過濾除菌備用。

1.1.3 培養基 PDA培養基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL；查氏培養基：NaNO33.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g， FeSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ATMT突變株構建載體改造 以pCAMBIA1300質粒為骨架，將其中的35S啟動子換成適于真菌表達的Trpc啟動子。pCAMBIA1300質粒用Xhol/EcoR1雙酶切后，膠回收后得到切除了35S啟動子及hph ORF的質粒pC1300-h。然后，以1003質粒為模板，TrphU/TrphL引物擴增含有Trpc啟動子及hph ORF的1345 bp片段，片段兩端加上Xhol/EcoR1酶切位點，膠回收片段后雙酶切，與pC1300-h連接得到ATMT突變株構建載體pC1300th(圖1)。具體構建方法參見Fu et al (2010)[8]。

(a)原始質粒；(b)改造后的質粒

1.2.2 ATMT轉化方法改進 將含有質粒pC1300th的農桿菌菌株AGL1在LB平板上(含50 μg/mL的利福平與卡那霉素)劃線活化48 h，然后挑單菌落轉到20 mL LB液體培養基(含50 μg/mL利福平和鏈霉素)28℃、220 rpm振蕩培養30 h；用5 mL IM培養基將生長4 d的木霉孢子沖洗后3層擦鏡紙過濾，顯微鏡計數，用40 mL IM培養基稀釋到終濃度1×106cfu/mL，28℃萌發6 h；測定農桿菌OD600，確定濃度；然后按量加入到100 mL IM培養基，終濃度達到OD600=0.3；28℃、240 rpm振蕩培養6 h，測定OD，達到0.6即可；將農桿菌與木霉孢子液等量混勻后，按每平皿200 μL涂IM平板，靜置30 min待水分吸干后，22℃共培養48 h；將玻璃紙轉移到含高濃度銅篩選培養基(對野生菌株致死)篩選。培養時間不超過5 d。挑選疑似的轉化子到CY培養基(含250 μg/mL特美汀及200 μg/mL潮霉素)，然后再用CY培養基(含250 μg/mL特美汀)傳5代后，單孢分離后轉接到含潮霉素的平板驗證；提取突變子的基因組DNA，PCR驗證。與傳統的方法相比，改進方法主要是在最后一步轉膜過程中，將共培養后的菌連同膜一起轉移到含有高于野生株致死濃度的銅培養基上，將未轉化的野生株及轉化后但銅耐受性未提高的轉化子全部殺死，最后能夠生長的即為耐銅的轉化子，原理見圖2。

圖2 ATMT方法改進示意圖

1.2.3 DNA提取及PCR驗證 DNA提取按照常規的CTAB法提取，-20℃凍存備用。通過PCR驗證目標菌株中是否含有T-DNA序列，引物序列為：

fhphU:TGTCCTGCGGGTAAATAGC

fhphL:TTGTTGGAGCCGAAATCC

用于擴增載體中的選擇標記基因潮霉素，產物為468 bp。

1.2.4 Southern blot 通過Southern blot驗證T-DNA插入拷貝數。樣品基因組DNA分別用限制性內切酶酶切后經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，80 V電泳2.5 h。將泡好的膠放入托盤，先把Marker所在的泳道切下，放入EB染液中染色；同時，將樣品膠放入到足量的脫嘌呤液，緩慢振蕩15 min，觀察膠上的溴酚藍變成黃色后，倒掉脫嘌呤液，無菌水清洗；加入足量的變性液，緩慢振蕩30 min，棄溶液，無菌水清洗3遍，再加入變性液重復處理1次；加入足量中和液緩按上述方法進行中和。同時，切和凝膠同樣長寬的尼龍膜和3張3 M濾紙，放入10×SSC溶液中潤濕。將2張17 cm的大濾紙交叉疊放在搭建的轉膜玻璃板上，將處理好的膠倒置放在上面，將潤濕的3層濾紙緊貼膠面上，轉膜24 h。轉膜結束后，取下吸水紙和濾紙，將凝膠和尼龍膜一起翻轉。將膜從膠上剝離，放入2×SSC溶液中漂洗5 min，取出平放在濾紙上，室溫晾30 min。將晾干的膜放在2張濾紙間，在烘箱80℃烘烤2 h后，錫紙包裹好保存備用。探針標記和雜交采用Gene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System Kit (Amersham)，操作根據說明書進行。預雜交至少1 h，加探針雜交16 h，洗膜、封膜后，進行X光拍照。

2 結果與分析

2.1 銅對野生株致死濃度測定

野生株活化后，打孔器取菌餅(0.5 mm直徑)轉接到含不同濃度Cu2+的PDA、YPDA及CYA培養基平板上，每12 h測量一次菌落直徑，計算銅對里氏木霉的致死濃度。結果表明(圖3)，當銅離子濃度達到2.0 mM時，里氏木霉不能在CYA培養基上生長，而在PDA及YPDA培養基上仍能生長；當銅離子濃度達到2.4 mM時，在PDA培養基上不能生長。而在YPDA培養基上，銅離子濃度達到3.6 mM時，才能完全抑制菌體生長。

(a)PDA培養基

(b)YPDA培養基

(c)CYA培養基

2.2 耐銅突變株構建

2.2.1 最佳銅離子濃度的確定 由于CYA培養基主要成份是無機鹽，成分明確，實驗重復性好，所以選用該培養基。為確定最佳的銅離子濃度(過高無法獲得突變株，過低假陽性多)，設置5個濃度：2.2 mM、2.5 mM、2.8 mM、3.1 mM、3.3 mM。以常規潮霉素平板篩選為對照，每個處理轉化20個平板(直徑9 cm)，實驗結果如表1。最佳的銅離子濃度為2.5 mM，此時，陽性率接近50%，而且獲得的總假定突變株也比較合適，平均0.45個/平板。因此，選擇該濃度為最佳銅離子濃度，用于大量構建并篩選高耐受銅的隨機突變株。

表1 改進的ATMT方法與常規方法比較

2.2.2 耐受銅突變株的構建篩選 使用上述條件共轉化320個平板，通過5代繼代培養及單孢分離，獲得純化的突變株。以潮霉素為引物通過PCR擴增表明，14個突變株具有468 bp的陽性條，說明初步篩選獲得了14個可能的突變株(圖4(a))。為了進一步驗證突變株，通過Southern blot對5個耐受性最強的突變株T-DNA拷貝數進一步驗證。結果表明，5個突變株中有3個突變株含有2個，拷貝數，2個突變株為單拷貝(圖4(b))。

(a)PCR驗證；(b)5個突變株用HindIII酶切后Southern blot驗證

圖4 突變株的驗證

3 結論與討論

3.1 改進前后方法比較

常規的農桿菌介導轉化(ATMT)突變株構建方法主要包含兩部分：共培養與篩選。按照常規的方法，大量篩選突變株將是一個費時費力的工作，如突變株的繼代培養，單孢分離，然后再測定銅的吸附能力等。而通過改進的方法后，獲得的突變株數量大大減少，而且得到的突變株全部是高耐受突變株，從中篩選高吸附突變株概率明顯增大。

與傳統方法相比，改進的ATMT方法有兩大優勢。

3.1.1 減少了篩選的工作量 從表2可知，按照常規方法，20個平板共獲得171可能的突變株；而改進后，僅獲得11個可能的突變株，僅相當于前者的6.4%，所以大大節省了后續的篩選工作。當大量構建突變株時(突變株達到上萬時)，這種優勢更明顯。另外，改進的方法獲得直接用高濃度銅來篩選，因此，獲得高耐受銅的突變株概率要比常規方法高。

3.1.2 減少材料損耗 共培養后，常規的方法通過使用抗生素(潮霉素與頭孢霉素)來篩選突變株，而改進的方法只用含銅的培養基篩選，大大節省了抗生素的使用，減少了費用及抗生素對環境造成的污染。以構建1萬株突變株(里氏木霉有9 000左右的蛋白，按1倍覆蓋量計算)為例，常規方法平均每皿(直徑9 cm)獲得5.2個真正的突變株(按表2 CK數據計算)，1萬突變株需要篩選1923皿，使用潮霉素與頭孢分別為30 g與60 g，而且傳代過程需要使用大量的培養基；而用改進的方法，在初篩選過程無需使用抗生素。

表2 ATMT方法優化前后的比較

注：潮霉素用量：0.2 g/L；頭孢霉素用量：0.25 g/L；每L培養基倒60個平板(直徑9 cm)。

3.2 改進方法使用過程注意事項

對突變株構建過程中的篩選步驟進行改進，用含高濃度銅的培養基直接篩選可能的轉化子，通過一系列實驗后優化出一種快速構建高耐受銅突變株方法。應用過程中需注意以下幾個方面。

1)木霉分生孢子生長。28℃倒置培養4 d，培養皿不能用palm膜封口，以免影響通氣而影響孢子質量。

2)農桿菌生長。農桿菌用IM培養基誘導培養時，起始OD值0.3左右，培養5 h后，測定OD值，如果OD值未達到0.6，可以離心濃縮。

3)共培養。共培養溫度23℃，時間48 h，過長時間產生假陽性太多。

4)覆蓋篩選。培養基溫度保持在50℃左右，以免燙死菌體。

在培養基中添加高濃度的銅離子(高于致死濃度)用于殺死未成功轉化的菌株，同時也可以殺死非耐受的突變株，因此獲得高耐受突變株的效率明顯提升。同時研究表明，與某些金屬離子如鋅等不同，銅離子的對細胞毒性是不可逆的，如WT在CY培養基上銅離子的致死濃度是2.0 mM，在該濃度下，培養時間延長菌體也未見生長，因此，用含高濃度銅離子的培養直接覆蓋不會誘導菌體的抗性而產生假陽性轉化子。

通過該方法共獲得15個高耐受銅突變株，銅吸附能力測定表明，其中一個突變株AT01銅吸附能力最高，每克菌絲吸附銅達到了12.73 mg，而WT僅為5.97 mg。吸附的最佳培養基初始pH值為5.0，培養最適溫度為28℃。同時，研究表明，大量吸附銅離子后，木霉的菌絲顏色明顯加深，這可以作為大量初篩選一個篩選指標，節省篩選周期。