益氣活血解毒方治療晚期上皮性卵巢癌療效相關(guān)靶基因篩選

李娟 翁潔瓊 盧雯平

摘要：目的? 采用mRNA芯片探究益氣活血解毒方維持治療晚期上皮性卵巢癌（AEOC）氣虛血瘀證療效相關(guān)基因靶點(diǎn)，明確其有效作用機(jī)制。方法? 觀察AEOC氣虛血瘀證患者服用益氣活血解毒方維持治療后的無進(jìn)展生存期（PFS），選取PFS最長的8例為敏感組，PFS最短的8例為不敏感組。采用mRNA芯片檢測2組患者治療后血液mRNA表達(dá)情況，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG、singal-net、path-net生物信息學(xué)分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證。結(jié)果? 益氣活血解毒方療效相關(guān)差異表達(dá)基因共1157個(gè)（P<0.05），其中上調(diào)基因497個(gè)，下調(diào)基因660個(gè)。qRT-PCR顯示，MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 益氣活血解毒方治療AEOC氣虛血瘀證患者的療效機(jī)制可能在于抑制MAPK3及與免疫通路相關(guān)的HLA-DOA、CD40、KIR2DL3靶基因。通過對益氣活血解毒方作用靶基因的探究，可為AEOC氣虛血瘀證微觀辨證及中醫(yī)精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：晚期上皮性卵巢癌;mRNA芯片;益氣活血解毒方;氣虛血瘀證;靶基因

中圖分類號：R273.731? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0028-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910465

Screening of Target Genes Related to Efficacy of Yiqi Huoxue Jiedu Decoction

for Advanced Epithelial Ovarian Cancer

LI Juan， WENG Jieqiong， LU Wenping

Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

Abstract： Objective To explore the gene targets related to efficacy of Yiqi Huoxue Jiedu Decoction for maintenance treatment of advanced epithelial ovarian cancer （AEOC） with qi deficiency and blood stasis syndrome using mRNA chip; To clarify effective mechanism. Methods Progression-free survival （PFS） of the AEOC patients with qi deficiency and blood stasis syndrome after taking Yiqi Huoxue Jiedu Decoction for maintenance treatment was observed， and 8 cases with the longest PFS （sensitive group） and 8 cases with the shortest PFS （insensitive group） were selected. Application of mRNA chip was used to detection the expression of mRNA in patients blood of two groups. And differentially expressed genes were analyzed by gene ontology， KEGG， singal-net， path-net bioinformatics analysis， and real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） for verification. Results Totally 1157 differentially expressed genes related to efficacy of Yiqi Huoxue Jiedu Decoction were screened out， of which 497 up-regulated genes and 660 down-regulated genes. qRT-PCR results showed that there was statistical significance in MAPK3， HLA-DOA， CD40 and KIR2DL3 （P<0.05）. Conclusion It is found that inhibition of MAPK3 pathway and co-regulating HLA-DOA， CD40 and KIR2DL3 related immune pathways may be an effective mechanism for Yiqi Huoxue Jiedu Decoction to treat AEOC patients with qi deficiency and blood stasis syndrome. The exploration of the target genes of Yiqi Huoxue Jiedu Decoction can provide the basis for the microscopic syndrome differentiation of AEOC with qi deficiency and blood stasis syndrome and the accurate treatment of TCM.

Keywords： advanced epithelial ovarian cancer; mRNA chip; Yiqi Huoxue Jiedu Decoction; qi deficiency and blood stasis syndrome; target genes

卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，75%的卵巢癌在診斷時(shí)已為晚期[1-2]。盡管抗血管生成藥物和聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶抑制劑已應(yīng)用于卵巢癌的維持治療中，并顯示出一定效果，但5年生存率仍不足40%，且因價(jià)格昂貴和伴隨高血壓及貧血等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用[3]。探究卵巢癌的生物學(xué)特點(diǎn)并尋找低毒價(jià)廉的維持治療方法已成為臨床迫切需要解決的問題[4]。

中醫(yī)藥在卵巢癌維持治療中應(yīng)用廣泛。益氣活血解毒方是我們在張錫純理沖湯基礎(chǔ)上加減而成，前瞻及真實(shí)世界的臨床研究均顯示其對晚期上皮性卵巢癌（advanced epithelial ovarian cancer，AEOC）的維持用藥可延長患者無進(jìn)展生存期（PFS），提高生活質(zhì)量，但有效作用機(jī)制尚未明確[5-6]。本研究采用人基因表達(dá)譜芯片，分析益氣活血解毒方治療AEOC氣虛血瘀證敏感人群與不敏感人群的差異表達(dá)基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析并驗(yàn)證，探究益氣活血解毒方治療AEOC氣虛血瘀證療效相關(guān)的基因靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

選擇2015年3月-2016年12月中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科門診經(jīng)益氣活血解毒方維持治療的AEOC患者300例，隨訪至2018年12月。PFS為3～45個(gè)月，服藥時(shí)間（24.0±1.6）月。選取PFS最長的8例為敏感組，PFS最短的8例為不敏感組。由于不敏感組1例血液樣本mRNA檢測時(shí)不符合Affymetrix的官方芯片質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)而排除，故為8︰7行療效相關(guān)差異基因分析。2組PFS比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;年齡、分期、手術(shù)后殘余腫瘤直徑、治療后糖類抗原（CA）125最低值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2014EC035）。

1.2? 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范》[7]，根據(jù)癥狀、體征、影像學(xué)檢查，并經(jīng)細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)檢查確認(rèn)，選取ⅢC/Ⅳ期的AEOC患者。分期采用2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期[8]。

1.3? 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[9]制定氣虛血瘀證辨證標(biāo)準(zhǔn)。癥見乏力，氣短，疼痛，膚色晦黯;舌脈：舌黯，有瘀斑，舌下靜脈青紫，舌苔薄白或有齒痕，脈弱而澀。

1.4? 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);②年齡18～80歲;③完成減瘤術(shù)未超過6個(gè)月;④完成6～8個(gè)周期的鉑類加紫杉醇類化療未超過1個(gè)月;⑤患者對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.5? 治療方法

患者均予益氣活血解毒方，藥物組成：黃芪30 g，女貞子15 g，枸杞子15 g，白術(shù)15 g，山藥15 g，三棱6 g，莪術(shù)9 g，青皮6 g，烏藥6 g，肉桂6 g，白花蛇舌草15 g，青蒿12 g。飲片由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥房提供。每日1劑，水煎取汁300 mL，早晚各1次口服。服藥半年后（若半年內(nèi)疾病進(jìn)展則在進(jìn)展時(shí)進(jìn)行）抽取外周血10～15 mL，采用mRNA提取試劑盒提取mRNA后保存。每3個(gè)月隨訪1次，隨訪至疾病進(jìn)展或至2018年12月研究結(jié)束。

1.6? mRNA提取及芯片檢測

采用IANGEN RNAprepPure血液總RNA提取試劑盒從患者外周血樣中提取總RNA，使用GeneChip 3 IVT PLUS Reagent Kit將總RNA制備為純化aRNA，并將其片段化后與GeneChip? PrimeViewTM Human Gene Expression Array芯片探針雜交、洗染、掃描等得到圖片和原始數(shù)據(jù)，篩選P<0.05且差異倍數(shù)>1.2的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

1.7? 生物信息學(xué)分析

為全面直觀地展示2組基因表達(dá)的關(guān)系及差異，將差異表達(dá)基因做無監(jiān)督層次聚類分析，以熱圖形式顯示。應(yīng)用基因本體論（GO）分析差異表達(dá)基因的主要功能，GO分析根據(jù)差異表達(dá)基因的分子功能和生物過程將基因分為不同層次類別，以揭示差異表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。利用京都基因與基因組百科全書（KEGG），分析差異表達(dá)基因的顯著通路[11]。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中信號通路的上下游關(guān)系，建立各通路間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（path-net）分析[12]。基于GO和KEGG分析，建立全局信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（signal-net）分析差異表達(dá)基因間的相互作用，以分析得到核心關(guān)鍵基因[13]。

1.8? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）采用Trizol試劑（Life Technologies）從血液樣本中分離總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）轉(zhuǎn)錄至cDNA。采用SYBR Green試劑（Bio-Rad）平行測定3次。采用2-ΔΔCt法通過相對定量方法比較2組mRNA表達(dá)量。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，2組PFS比較采用非參數(shù)估計(jì)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)）;計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，2組一般資料比較采用Fisher確切概率法;等級資料采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 療效相關(guān)差異表達(dá)基因及聚類分析

經(jīng)益氣活血解毒方治療，2組mRNA芯片檢測得到差異表達(dá)基因1157個(gè)，其中上調(diào)基因497個(gè)，下調(diào)基因660個(gè)。聚類圖見圖1。

2.2? 療效相關(guān)差異表達(dá)基因基因本體論分析

對療效相關(guān)差異表達(dá)基因行GO分析。前10個(gè)上調(diào)基因涉及核轉(zhuǎn)錄mRNA分解代謝過程，SRP依賴的共翻譯蛋白靶向膜，核糖體RNA加工，病毒轉(zhuǎn)錄，平移起始，淀粉樣前體蛋白生物合成過程的監(jiān)管，氣管腺體發(fā)育，翻譯，基因表達(dá)，B細(xì)胞增殖，詳見表2。

前10個(gè)下調(diào)基因涉及嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒，消化絲氨酸磷酸化，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，脂肪墊的開發(fā)，GTPase活性的正調(diào)控，受體活性的正調(diào)控，細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)，毛囊成熟，細(xì)胞脂代謝過程，詳見表3。

2.3? 療效相關(guān)差異表達(dá)基因的京都基因與基因組百科全書分析

對療效相關(guān)差異表達(dá)基因行KEGG分析。前10個(gè)上調(diào)的通路涉及同種異體移植排斥，自身免疫性甲狀腺疾病，B細(xì)胞受體信號通路，造血細(xì)胞譜系，抗原處理及呈遞，EB病毒感染，病毒性心肌炎，核糖體，移植物抗宿主病，Ⅰ型糖尿病，詳見表4。

前10個(gè)下調(diào)的通路涉及MAPK信號通路，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥，癌癥蛋白聚糖，黏著斑，促性腺激素信號通路，補(bǔ)體和凝血級聯(lián)，T細(xì)胞受體信號通路，Rap1信號通路，F(xiàn)oxO信號通路，詳見表5。

2.4? 相互作用網(wǎng)絡(luò)分析療效相關(guān)差異表達(dá)基因觸發(fā)的核心通路

基于顯著差異通路的數(shù)據(jù)，path-net分析揭示了益氣活血解毒方治療后療效相關(guān)的核心通路。Degree≥10的核心通路及上下調(diào)情況為MAPK信號通路下調(diào)，T細(xì)胞受體信號通路下調(diào)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)下調(diào)，抗原處理及呈遞上調(diào)，補(bǔ)體和凝血級聯(lián)下調(diào)，B細(xì)胞受體信號通路上調(diào)，細(xì)胞黏附分子上調(diào)，癌癥通路下調(diào)。信號通路的度越高，說明其受到其他通路的調(diào)控或被其他通路調(diào)控，其在信號網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。見表6、圖2。

2.5? 療效相關(guān)差異表達(dá)基因觸發(fā)的核心基因

根據(jù)差異表達(dá)基因顯著的GO功能和KEGG通路富集，signal-net分析揭示了該方維持治療差異療效的核心基因。在signal-net中獲得了120個(gè)關(guān)鍵基因，更高的度表明這些基因與其他基因具有很強(qiáng)相關(guān)性，它們在信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著更重要的作用。見圖3。

Degree≥6的核心基因是MAPK3，AKT3，MAPK13，MAPK14，CTNNB1，F(xiàn)OXO3，MYC，GNG12，ENTPD1，PPP2R1B。見表7。

2.6? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

對2組患者行qRT-PCR驗(yàn)證可能的靶基因，與不敏感組比較，敏感組MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3的基因表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表8。

3? 討論

卵巢癌致死率高，精準(zhǔn)治療是未來趨勢。前期臨床研究表明，益氣活血解毒方維持治療AEOC氣虛血瘀證可提高PFS，但相同證型的患者中藥治療后的PFS不盡相同，證型與體質(zhì)密切相關(guān)，體質(zhì)稟于先天、關(guān)于后天[14-16]。本研究從mRNA角度探討益氣活血解毒方的有效機(jī)制，通過探究治療優(yōu)勢人群作用靶基因，為AEOC氣虛血瘀證微觀辨證及中醫(yī)精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。本研究通過mRNA芯片檢測益氣活血解毒方維持治療2組的差異表達(dá)基因并分析驗(yàn)證，得到一些可能的靶基因。

益氣活血解毒方敏感組自然殺傷細(xì)胞抑制性受體KIR2DL3下調(diào)，提示該方可能通過下調(diào)KIR2DL3發(fā)揮抗腫瘤作用。KIR2DL3是自然殺傷細(xì)胞的KIR抑制性受體，阻斷自然殺傷細(xì)胞抑制性KIR受體與腫瘤細(xì)胞KIR配體間的結(jié)合，有助于恢復(fù)自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤作用，此為自然殺傷細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)阻斷療法的理論依據(jù)。MD安德森癌癥中心發(fā)起的抗KIR藥物L(fēng)irilumab治療骨髓異常增生綜合癥研究顯示安全性和有效性良好[17]。本研究中，敏感組患者KIR2DL3明顯下調(diào)，只有不敏感組的60%，說明益氣活血解毒方可通過下調(diào)KIR2DL3釋放腫瘤微環(huán)境中的免疫剎車，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤作用。

本研究顯示，敏感組HLA-DOA表達(dá)下調(diào)，抗原處理及呈遞通路上調(diào)。人類白細(xì)胞抗原DM（HLA-DM）可對腫瘤抗原肽編輯以便被CD4+T細(xì)胞識(shí)別，DO分子對HLA-DM分子功能有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，HLA-DOA表達(dá)水平可以反映機(jī)體抗腫瘤免疫監(jiān)視的強(qiáng)弱[18]。提示益氣活血解毒方可能是通過提高腫瘤微環(huán)境中抗原呈遞能力，如下調(diào)HLA-DOA、上調(diào)HLA-DM，以上調(diào)CD4+T細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而提高抗腫瘤免疫效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，敏感組CD40的表達(dá)下調(diào)，對患者的生存起正面影響。CD40是腫瘤壞死因子受體（TNF-R）超家族成員，對腫瘤細(xì)胞具有促增殖和促凋亡的雙重作用，可促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤擴(kuò)散[19-20]，作為免疫應(yīng)答中的共刺激分子提高免疫識(shí)別，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[21-22]，可與CD4+T細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)T細(xì)胞活化[23]，CD40的雙重作用可能導(dǎo)致它在腫瘤生長和抑制中的角色較為復(fù)雜。Qu等[24]發(fā)現(xiàn)，CD40可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移。故益氣活血解毒方可能通過下調(diào)CD40延長卵巢癌患者的生存期。CD40在促進(jìn)T細(xì)胞活化的缺失，可由其他刺激因子彌補(bǔ)，如上述HLA-DOA的下調(diào)機(jī)制。

本研究顯示，敏感組MAPK通路下調(diào)，ERK1（MAPK3）基因下調(diào)。MAPK通路異常激活能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，越來越多的證據(jù)表明，MAPK通路可以促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，抵抗免疫療法[25]。抑制MAPK通路可顯著提高免疫療法的療效，主要通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞、增強(qiáng)MHC-Ⅰ表達(dá)、抑制Tregs擴(kuò)增等途徑，MAPK通路抑制劑聯(lián)合免疫療法是腫瘤治療的新方向[26]，目前正在進(jìn)行的幾項(xiàng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合MAPK通路抑制劑的臨床試驗(yàn)早期結(jié)果顯示，對腫瘤生長有協(xié)同抑制作用，對患者生存有益[27-28]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是MAPK通路的中心成員，MAPK/ERK通路異常活化是控制85%以上的人類癌癥細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥的關(guān)鍵[29-30]。表明該通路和基因可能是益氣活血解毒方的有效靶點(diǎn)。

我們利用預(yù)測生存和預(yù)后價(jià)值的Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3與Ⅲ/Ⅳ期AEOC患者PFS之間的關(guān)系[31]。結(jié)果提示，MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3的mRNA表達(dá)為危險(xiǎn)因素，其表達(dá)越低，患者預(yù)后越好。

綜上，益氣活血解毒方治療AEOC氣虛血瘀證患者的機(jī)制可能在于抑制MAPK通路，協(xié)同調(diào)節(jié)HLA-DOA、CD40、KIR2DL3相關(guān)免疫通路，以提高抗原呈遞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng);益氣活血解毒方治療的優(yōu)勢人群可能為對MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3敏感的人群;通過對益氣活血解毒方治療優(yōu)勢人群作用靶基因的探究，可為AEOC氣虛血瘀證微觀辨證及中醫(yī)精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

本研究為中醫(yī)藥有效機(jī)制探討提供了新思路。但只檢測了中藥治療后患者mRNA表達(dá)水平，未檢測服藥前后表達(dá)變化。下一步擬開展臨床研究，檢測益氣活血解毒方維持治療前后HLA-DOA、CD40、KIR2DL3、MAPK3基因的mRNA和蛋白表達(dá)，分析與患者生存的關(guān)系，進(jìn)一步明確益氣活血解毒方治療該病的有效機(jī)制和靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2019-10-29）

（修回日期：2019-11-21;編輯：季巍巍）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81473566）

通訊作者：盧雯平，E-mail：lu_wenping@sina.com