澤瀉炮制前后化學成分及其利尿作用研究

嚴桂杰 藍夢柳 丘建芳 李小艷 許文 吳水生

摘要：目的? 分析比較澤瀉飲片麩炒、鹽炙、土炒、酒炙炮制前后14種三萜類成分的含量，探討澤瀉及其不同炮制品的利尿作用。方法? 采用超高液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS），色譜柱為Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，單四級桿質譜采用正離子SIR模式，測定澤瀉生品和炮制品飲片中16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇L、24-乙酰澤瀉醇F、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B共14種三萜類成分的含量，探討澤瀉炮制過程中化學成分含量變化;采用水負荷大鼠代謝籠法，比較澤瀉炮制前后的利尿作用。結果? 經方法學驗證，所建立UPLC-MS同時測定澤瀉飲片中14種三萜類成分的方法符合分析要求。與生品比較，澤瀉炮制品化學成分最主要的變化是澤瀉三萜類24、25位環氧環發生開環轉化，23-乙酰澤瀉醇B、澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C含量下降，而澤瀉醇A類化合物含量升高，且鹽炙澤瀉的化學成分轉化最為明顯。動物實驗結果顯示：生品組和各炮制品組1 h尿量較空白對照組顯著增加，且利尿效應酒炙品>土炒品>麩炒品>鹽炙品>生品;生品組和鹽炙品組2 h尿量與空白對照組比較差異無統計學意義，而酒炙品組、土炒品組、麩炒品組尿量較空白對照組顯著增加，且利尿效應酒炙品>土炒品>麩炒品。結論? 本研究建立的UPLC-MS測定澤瀉生品及不同炮制品中化學成分含量方法準確、快速。澤瀉炮制后化學成分發生明顯變化，澤瀉經酒炙、土炒和麩炒后較生品利尿作用顯著增強。

關鍵詞：澤瀉;炮制;超高液相色譜-質譜聯用;含量測定;利尿;大鼠

中圖分類號：R283.1? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0059-07

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906015

Study on Changes of Chemical Composition and Diuretic Effect in

Alismatis Rhizoma after Processing

YAN Guijie1，2， LAN Mengliu1， QIU Jianfang1， LI Xiaoyan1， XU Wen1，2， WU Shuisheng1，2

1. School of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China; 2. Centre of Biomedical Research & Development， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China

Abstract： Objective To analyze the contents of 14 kinds of triterpenoids composition and diuretic effect of Alismatis Rhizoma before and after processing， including stir-frying with bran， stir-frying with salt-water， stir-frying with soil， and stir-frying with wine. Methods The UPLC-MS method was performed on a Waters CORTECS UPLC C18 column （2.1 mm × 100 mm， 1.6 μm） with a gradient elution using acetonitrile and water to quantitative analysis of the 14 triterpenoids （16-oxo-23-acetate-alisol A， 16-oxo-24-acetate-alisol A， alisol C， alisol F， alisol C 23-acetate， alisol L， alisol F 24-acetate， alisol A， alisol A 23-acetate， alisol A 24-acetate， alisol G， alisol B， alisol B 23-acetate， 11-deoxy-alisol B） of crude Alismatis Rhizoma and processed products. The method of metabolizable cage of rats was adopted to study the difference of diuretic effect of Alismatis Rhizoma before and after processing. Results Through methodological verification， the method of simultaneous determination of 14 triterpenoids in Alismatis Rhizoma by the established UPLC-MS met the analytical requirements. Compared with crude Alismatis Rhizoma， the most?important processing change in the 14 triterpenoids of Alismatis Rhizoma was the ring-opening at 24， 25 epoxy rings in the triterpenoids. The contents of alisol B 23-acetate， alisol B， 11-deoxy alisol B and alisol C 23-acetate decreased， and the content of alisol A increased. The conversion was most significant in stir-frying with salt-water. The results of the rats experiment showed that compared with the control group， the urine output of crude and processed products of Alismatis Rhizoma significantly increased within 1 h， and the diuretic effect of Alismatis Rhizoma processed products， stir-frying with wine > stir-frying with soil > stir-frying with bran > stir-frying with salt-water > crude Alismatis Rhizoma; there was no statistical significance in urine output of crude and stir-frying with salt-water within 2 h， Alismatis Rhizoma processed products of stir-frying with wine， soil， and bran significantly increased compared with the control group， and the diuretic effect of stir-frying with wine > stir-frying with soil > stir-frying with bran. Conclusion The established UPLC-MS method is accurate and rapid for the determination the chemical composition of different processed products of Alismatis Rhizoma. The chemical composition of Alismatis Rhizoma processed products changes after the processing， and the diuretic effect of the stir-frying with wine， soil and bran of Alismatis Rhizoma increases.

Keywords： Alismatis Rhizoma; processing; UPLC-MS; content determination; diuretic effect; rats

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖[1]，味甘，性寒，歸腎、膀胱經，用于治療水腫脹滿、泄瀉尿少、小便不利等。澤瀉炮制方法較多，始載于南北朝《雷公炮炙論》“凡使不計多少，細銼，酒浸一宿，漉出，暴干任用也”;除酒炙外，《得配本草》記載澤瀉“滋陰利水鹽水炒”“健脾生用或酒炒用”“麩炒可緩和藥性，長于滲濕和脾”，《本經逢原》有“利小便生用，入補劑鹽、酒炒”等論述。可見，澤瀉炮制方法主要有酒炙、鹽炙、麩炒等，且不同炮制品的功效不同。

澤瀉有利水滲濕功效，其炮制品利尿效應有所差異。如曾春暉等[2]采用代謝籠法和稱重法研究顯示，廣西澤瀉鹽炙前后對正常小鼠尿量、肺和腦含水量均無顯著影響，但能明顯增加水腫模型小鼠尿量，減輕肺水腫程度。澤瀉鹽炙后化學成分發生改變可能是其炮制前后利尿作用差異的主要原因[3]。目前關于澤瀉生品與多種炮制品利尿作用對比研究的報道較少。本研究以澤瀉不同炮制品炮制前后14種化學成分的含量變化結合利尿效應評價，探討澤瀉炮制過程化學成分的轉化及其利尿作用的變化，為澤瀉的臨床應用提供參考。

1? 儀器、試藥與動物

Waters SQD Ⅱ MS system（美國沃特世公司），Waters超高液相色譜儀（美國沃特世公司），大鼠代謝籠（意大利Tecniplast公司），RE-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），HH-S型水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司），YP202N分析天平（上海精密科學儀器有限公司）。

澤瀉購于福建省建甌市GAP產地，經福建中醫藥大學藥用植物實驗室范世明高級實驗師鑒定為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖，于福州回春藥業GMP車間切片并制備不同炮制品。對照品16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇L、24-乙酰澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B，均為本實驗室制備，經峰面積歸一法測定純度均大于98%;16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A因自制對照品不穩定，經校正因子計算后定量使用[4]。內標物甘草次酸（批號14082210，成都曼思特生物科技有限公司，純度>99.10%），甲酸（色譜純，美國ROE Scientific Inc），乙腈（色譜純，德國默克公司），超純水，氫氯噻嗪片（批號A170804，山西云鵬制藥有限公司），吐溫-80（批號20170320，天津市福晨化學試劑廠）。

清潔級雄性SD大鼠80只，體質量（200±20）g，上海斯萊克公司提供，動物合格證號SCXK（滬）2017-0005，飼養于SPF級環境，適應性喂養1周，自由進食飲水。

2? 方法與結果

2.1? 不同炮制品制備

鹽炙品：200 g澤瀉用26 mL鹽水（4.0 g鹽），悶潤透，100 ℃炒制8 min[5];麩炒品：每200 g澤瀉用30 g麥麩，200 ℃炒制3 min;酒炙品：每200 g澤瀉用20 mL黃酒，悶潤1 h，140 ℃炒制8 min;土炒品：每200 g澤瀉用60 g黃土，210 ℃炒制1.5 min[6]。

2.2? 大鼠灌胃液制備

取澤瀉生品及鹽炙品、麩炒品、酒炙品、土炒品各200 g，粉碎，過60目篩，加8倍量85%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，冷卻，過濾，減壓濃縮至無醇味，用1%吐溫-80配制成相當于原藥材1.25 g/kg的藥液，即得澤瀉生品及不同炮制品的大鼠灌胃液。取氫氯噻嗪片，研磨成細粉，用1%吐溫-80配制成0.005 g/kg的溶液，備用。

2.3? 對照品溶液制備

稱取14種對照品和內標物甘草次酸，精密稱定，分別用乙腈制成16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基- 24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、澤瀉醇L、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇F濃度分別為0.430、0.442、1.490、1.125、1.304、0.332、0.254、0.324、0.525、1.352、1.360、2.248、0.435、1.060 mg/mL對照品貯備液及甘草次酸濃度為1.0 mg/mL的內標貯備液。分別吸取對照品貯備液適量，用乙腈稀釋成混合對照品溶液及梯度濃度的對照品溶液，內標溶液濃度為500 ng/mL。

2.4? 供試品溶液制備

取澤瀉生品及不同炮制品各約1.0 g，精密稱定，加入25 mL色譜乙腈于50 mL具塞三角瓶中，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷后補足減失的質量，10 000 r/min離心10 min，取上清液。取不同上清液各50 μL，分別加入950.0 μL內標溶液，渦旋1 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析。

2.5? 檢測條件

色譜條件：色譜柱為Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 mm），流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，45%～85%B;5～6 min，85%～95%B;6～6.5 min，95%～95%B），流速0.30 mL/min，進樣量1 μL，柱溫45 ℃。

質譜條件：離子源為ESI源，檢測方式為正離子檢測（正離子模式響應強度優于負離子），掃描方式為SIR模式，對澤瀉三萜類成分進行質譜調諧，因澤瀉三萜單體均成加Na+分子離子峰，故選擇[M+Na]+分子離子峰作為定量離子峰。其他參數：萃取因子Ex 2.00 V，RF系數0.1 V，去溶劑氣流500 L/Hr，錐孔氣流50 L/Hr，源溫度150 ℃，去溶劑溫度200 ℃，錐孔電壓（cone）40 V。

數據采用Waters MassLynx 4.1軟件進行分析。各待測物和內標物相關參數見表1，澤瀉中14種成分UPLC圖見圖1。

2.6? 方法學考察

2.6.1? 線性關系考察

精密吸取各梯度濃度混合對照品溶液50 μL，分別加入950.0 μL內標物溶液，渦旋1 min，0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣分析，考察分析物和內標物的峰面積之比（Ai/As）與分析物濃度的線性關系，計算回歸方程及相關系數。以信噪比（S/N）=3確定分析物的檢測限（LOD），以S/N=10確定定量限（LOQ），結果見表2。

2.6.2? 精密度試驗

取“2.3”項下混合對照品溶液，按“2.5”項下色譜條件、質譜條件進行分析，1 d內平行進樣6次，連續進樣3 d，記錄16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇L、24-乙酰澤瀉醇F、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B和11-去氧澤瀉醇B的峰面積與內標的比值，計算日內精密度和日間精密度，結果見表3，表明儀器精密度良好。

2.6.3? 重復性試驗

精密稱取同批次澤瀉樣品6份，按“2.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.5”項下色譜、質譜條件進行分析，計算其含量及RSD，結果見表3，表明本試驗建立的方法重復性良好。

2.6.4? 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣分析，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性較好，見表3。

2.6.5? 加樣回收率試驗

取同一批次澤瀉供試品溶液，精密量取0.5 g，置50 mL三角瓶中，平行6份，分別精密加入近似1∶1含量的16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、23-乙酰澤瀉醇C、澤瀉醇L、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇G、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B和11-去氧澤瀉醇B的對照品貯備液，N2吹干溶劑，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜、質譜條件進行分析，根據回歸方程得含量，并計算平均回收率和RSD，結果見表4，表明本方法回收率良好。由于澤瀉生品及其不同炮制品均未檢出24-乙酰澤瀉醇F，所以未進行該成分加樣回收率試驗。

2.7? 樣品測定

按上述方法，測定澤瀉生品及炮制品中14種成分含量，結果見表5（其中24-乙酰澤瀉醇F均未檢出）。23-乙酰澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇C的炮制化學轉化可能途徑見圖2。

2.8? 澤瀉及其炮制品對大鼠尿量的影響

大鼠禁食18 h后，按25 mL/kg灌胃超純水，收集2 h尿量，尿量達灌服量40%以上者為合格動物。篩選出水負荷尿量合格的70只大鼠，按體質量隨機分為空白對照組、氫氯噻嗪組、生品組、麩炒品組、鹽炙品組、土炒品組、酒炙品組，每組10只。大鼠禁食不禁水18 h，按25 mL/kg灌胃超純水，形成水負荷模型。30 min后擠壓膀胱排盡余尿，給藥組大鼠按20 mL/kg分別灌胃相應藥液，空白對照組灌胃等量1%吐溫-80，將大鼠立即置于代謝籠內，每隔1 h記錄1次累積尿量，共記錄2 h[7]。

與空白對照組比較，氫氯噻嗪組大鼠尿量明顯增加（P<0.01），生品組及各炮制品組1 h尿量不同程度增加（P<0.05，P<0.01），利尿效應酒炙品>土炒品>麩炒品>鹽炙品>生品;生品組和鹽炙品組2 h尿量與空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），而酒炙品組、土炒品組、麩炒品組尿量較空白對照組顯著增加，利尿效應酒炙品>土炒品>麩炒品（P<0.05，P<0.01）。結果見表6。

3? 討論

生澤瀉利水而不傷陰;鹽澤瀉能引藥下行，可增強滋陰、利水作用[8]。澤瀉炮制品的化學成分含量變化研究已有報道，曹柳等[9]采用HPLC研究清炒、麩炒、鹽炙對澤瀉中澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B和23-乙酰澤瀉醇B含量的影響，與生澤瀉比較，清炒品中上述4種成分含量均降低，麩炒品均增加，鹽炙品除23-乙酰澤瀉醇B外均有所增加。韓偉健等[10]采用基于1H NMR的代謝組學方法分析了澤瀉鹽炙過程中的化學成分變化，并建立了追蹤、識別中藥復雜成分在炮制過程中變化的分析方法，結果表明澤瀉生品飲片與鹽炙品飲片成分差異較大，提示澤瀉鹽炙過程中原萜烷型澤瀉醇類成分可能發生脫水、脫乙酰基和氧化反應。鄭云楓等[11]發現，高溫炮制過程中，澤瀉藥材中三萜類主成分23-乙酰澤瀉醇B出現2條轉變途徑：一條是氧環開裂并重排生成24-乙酰澤瀉醇A，進一步脫乙酰基轉化成澤瀉醇A;另一條是先脫乙酰基生成澤瀉醇B，繼而氧環開裂轉化成澤瀉醇A。這些研究為深入了解澤瀉炮制過程中化學成分的轉化提供了重要依據，但多數實驗的檢測指標有限，主要集中于23-乙酰澤瀉醇B和澤瀉醇A。

本研究表明，澤瀉不同炮制品中的總三萜含量均有下降，其中澤瀉醇L、澤瀉醇G、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、23-乙酰澤瀉醇B、11-去氧澤瀉醇B的含量與澤瀉生品比較均有不同程度下降，而炮制品中16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A、16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇C、澤瀉醇F、澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A的含量與澤瀉生品比較均不同程度升高。結合14種三萜類成分的化學結構，含量下降的化合物多含有23、24環氧化結構，而其開環后的澤瀉醇A類成分含量均升高，以2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）澤瀉項下指標性成分23-乙酰澤瀉醇B為例，無論生品還是炮制品中，該成分含量均最高，且炮制品中該成分含量均較生品有一定程度下降，可能產生了圖3所示的轉化，即23-乙酰澤瀉醇B的23、24位環氧環開環裂解產生23-乙酰澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A，導致多數炮制品中23-乙酰澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A含量升高，同時由于23-乙酰澤瀉醇A或24-乙酰澤瀉醇A進一步脫乙酰基后產生澤瀉醇A，故澤瀉醇A也不同程度增加。

另外，23-乙酰澤瀉醇B在炮制過程中脫乙酰基也可轉化為澤瀉醇B，澤瀉醇B環氧開環則轉化為澤瀉醇A。從含量測定結果可以看出，鹽炙澤瀉23-乙酰澤瀉醇B含量與生品比較差異有統計學意義，同時轉化生成的澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇A含量也最高，澤瀉醇B也大量轉化為澤瀉醇A。雖然其他炮制品23-乙酰澤瀉醇B含量較生品無明顯差異，但由于23-乙酰澤瀉醇B含量非常高，其少量轉化就會引起炮制品中澤瀉醇A類成分含量增加，故炮制品中澤瀉醇A類成分含量均較生品顯著提高。

23-乙酰澤瀉醇C是23-乙酰澤瀉醇B母核16位加羰基的化合物，其與23-乙酰澤瀉醇具有相同的23、24位環氧環結構。從含量測定結果來看，炮制品中16-羰基-23-乙酰澤瀉醇A和16-羰基-24-乙酰澤瀉醇A含量均明顯高于生品，同樣以鹽炙澤瀉最為明顯。與23-乙酰澤瀉醇B不同的是，23-乙酰澤瀉醇C的降解炮制品與生品有明顯差異，說明可能由于16位羰基的引入，使其炮制過程裂解開環或脫乙酰基轉化更為容易，同時產生大量澤瀉醇C，故不同炮制品中澤瀉醇C的含量均較生品顯著提高。另外，澤瀉醇C可能通過23、24位環氧環開環裂解及16羰基與23位羥基的環合生成澤瀉醇F，故澤瀉炮制品中澤瀉醇F含量均有顯著提高。

澤瀉中的澤瀉醇L、11-去氧澤瀉醇B可能同樣發生23、24位開環，導致炮制后含量不同程度下降。澤瀉醇G可能發生其他降解，從測定結果發現，其在生品中有少量存在，但炮制后除鹽炙品外基本消失。本試驗還同時測定了24-乙酰澤瀉醇F，但所有生品和炮制品中均未檢測到24-乙酰澤瀉醇F，說明炮制過程中發生的脫乙酰基轉化為單向轉化的不可逆反應。另外，鹽炙澤瀉的14種三萜類成分總量與生品比較差異有統計學意義，另外幾種炮制品也不同程度減少，說明除上述成分轉化外，澤瀉三萜在炮制過程中還存在其他轉化途徑或降解破壞。

澤瀉生品及不同炮制品的利尿效應研究表明，與空白對照組比較，澤瀉生品及炮制品在1 h內均有一定利尿作用，且炮制前后的利尿作用沒有明顯差異，酒炙品組、麩炒品組和土炒品組在2 h內的利尿作用均優于生品組，尤其酒炙品組的1、2 h利尿效果均最好，而從化學成分變化角度，酒炙澤瀉與其他幾種炮制品各三萜成分含量或總三萜含量并無明顯差異，說明在酒炙過程中發生的成分轉化所達到的組分間的配伍比例（內部構成比）可能較其他炮制過程更佳，從而導致其利尿效果最佳。在中藥有效性研究中，除關注指標性成分含量外，其構成比也是藥效表征的重要依據，因而對臨床中藥飲片的質量控制應建立整體質控模式。

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（收稿日期：2019-05-31）

（修回日期：2019-06-22;編輯：陳靜）

基金項目：國家自然科學基金（81773956）

通訊作者：吳水生，E-mail：wushuishengwss@163.com