何首烏“九蒸九曬”炮制工藝優選及對L02肝細胞生長的影響

劉夢嬌 蒲俊安 戴冰 楊全偉 張志國 楊磊

摘要：目的? 探索何首烏“九蒸九曬”最佳炮制工藝及不同炮制品對正常人L02肝細胞生長的影響。方法? 選擇蒸制時間、炮制次數、曬制時間3個因素，采用L9（34）正交試驗，以二苯乙烯苷、游離蒽醌、結合蒽醌含量為考察指標，優選炮制工藝;以細胞抑制率為評價指標，考察何首烏不同炮制品對L02肝細胞生長的影響。結果? 優選的何首烏“九蒸九曬”最佳炮制工藝為：蒸制4 h，曬制4 h，蒸曬11次。優選炮制品的肝細胞抑制率為2.86%，藥典法炮制品的肝細胞抑制率為23.67%。結論? 本研究優選的何首烏“九蒸九曬”炮制工藝結果可靠，評價指標可控，所得炮制品的肝細胞抑制率低于藥典法炮制品。

關鍵詞：何首烏;九蒸九曬;正交試驗;L02肝細胞

中圖分類號：R283.3;R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）04-0070-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201904391

Optimization of Processing Technology of “Nine-time Repeat Steaming and Sun-drying Process” of Polygoni Multiflori Radix and Effects on L02 Hepatocytes

LIU Mengjiao1， PU Junan1， DAI Bing2， YANG Quanwei3， ZHANG Zhiguo2，4， YANG Lei2，4

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. The First Hospital Affiliated to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 3. The First Hospital of Wuhan City， Wuhan 430022， China; 4. ZHANG Zhiguo Heritage Studio Related to the Old Chinese Medicine Experts， Changsha 410007， China

Abstract： Objective To explore the optimum processing technology of traditional “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix and the effects of different products on human normal L02 hepatocytes. Methods Three factors， such as steaming time， drying times and processing time， were selected. L9（34） orthogonal test was adopted， and TSG， free anthraquinones and combined anthraquinones were set as indicators for optimization of processing technology; the effect of different products of Polygoni Multiflori Radix on L02 hepatocytes was investigated by setting the inhibition rate as evaluation index. Results The optimum processing technology of “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix was steaming for 4 hours， drying for 4 hours and steaming for 11 times， and the inhibition rate of hepatocytes was 2.86%; the inhibition rate of hepatocytes of Pharmacopoeia processing method was 23.67%. Conclusion The optimum processing technology of “nine-time repeat steaming and sun-drying process” of Polygoni Multiflori Radix is reliable， and the evaluation index is controllable. The inhibition rate of hepatocytes is lower than that of the Pharmacopoeia method.

Keywords： Polygoni Multiflori Radix; nine-time repeat steaming and sun-drying process; orthogonal text; L02 hepatocyte

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，生品主要功效為解毒、消癰、截瘧、潤腸通便，炮制品可補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁降脂[1]。何首烏及其中成藥應用非常廣泛，但國內外有關何首烏致肝損傷事件頻發[2]，其肝毒性物質研究主要集中于二苯乙烯苷類及蒽醌類成分[3-4]。“九蒸九曬”是何首烏的經典炮制方法，從宋代沿用至明、清，鮮有毒性記載[5]。今多簡化，2015年版《中華人民共和國藥典》制何首烏的炮制方法要求“蒸至內外呈黑褐色”。古今炮制方法的差異可能是其臨床毒副反應發生的重要因素之一。有學者對其古今炮制方法進行相關研究，探討了肝毒性物質基礎及其潛在影響因素[6-7]。本研究采用正交試驗法對何首烏“九蒸九曬”古法炮制工藝進行優選，并考察古法“九蒸九曬”與藥典法炮制品對正常人L02肝細胞活性的影響，為規范何首烏炮制工藝及質量標準的制定提供參考。

1? 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（德國安捷倫科技公司），AR2140型電子分析天平（上海海鴻精密儀器有限公司），Galaxy170R型恒溫培養箱（海躍進醫療儀器廠），SW-CJ-2G超凈工作臺（美國Thermo Scientific公司），ELx800酶標儀（美國BioTek公司），Primo Vert型熒光倒置顯微鏡（北京瑞科中儀科技有限公司），5804R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

何首烏（批號20182019），湖南南國藥都中藥飲片有限公司，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院張志國教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根;黑豆，市售;二苯乙烯苷對照品（批號110844-201512）、大黃素對照品（批號0756-9908），中國食品藥品檢定研究院;大黃素甲醚對照品（批號MUST-12022005），成都曼思特生物科技有限公司;正常人L02肝細胞，上海生博生物醫藥公司;高糖DMEM培養基，上海立菲生物技術公司;胎牛血清、PBS，美國Gibco公司;DMSO，美國Amresco公司;胰酶，北京Solarbio公司;CCK-8試劑盒，七海生物公司;乙腈、甲醇、乙醇為色譜純，水為純水，其他試劑為分析純。

2? 方法與結果

2.1? 二苯乙烯苷含量測定

2.1.1? 色譜條件

色譜柱為Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（25∶75），檢測波長320 nm，流速1 mL/min，進樣量10 ?L，柱溫30 ℃。

2.1.2? 對照品溶液制備

精密稱取二苯乙烯苷對照品適量，用稀乙醇溶解，制成0.21 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3? 供試品溶液制備

精密稱取正交試驗炮制的9份何首烏樣品粉末各0.2 g，按2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）何首烏含量測定二苯乙烯苷項下方法制備，即得。

2.1.4? 樣品含量測定

按“2.1.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 ?L進樣測定，色譜圖見圖1。

2.2? 蒽醌類含量測定

2.2.1? 色譜條件

色譜柱為Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸溶液-甲醇（20∶80），檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 ?L，流速1 mL/min。

2.2.2? 對照品溶液制備

分別精密稱取大黃素甲醚和大黃素對照品適量，用甲醇溶解，制得濃度分別為大黃素0.54 mg/mL、大黃素甲醚0.85 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3? 供試品溶液制備

精密稱取正交試驗炮制的9份何首烏樣品粉末各1 g，按2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）何首烏含量測定結合蒽醌項下方法制備，即得。

2.2.4? 樣品含量測定

按“2.2.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 ?L進樣測定，色譜圖見圖2。結合蒽醌含量=總蒽醌含量-游離蒽醌含量。

2.2.5? 正交試驗

根據文獻及前期研究結果[8-10]，對炮制次數（A）、蒸制時間（B）、曬制時間（C）進行考察，各因素選取3個水平，以何首烏質量指標性成分二苯乙烯苷、游離蒽醌及結合蒽醌含量作為評價指標，采用綜合評分法進行評價。根據各成分對何首烏功效的作用大小設計權重，二苯乙烯苷、游離蒽醌及結合蒽醌權重系數分別為0.60、0.20、0.20。綜合評分=（該組二苯乙烯苷含量×60÷二苯乙烯苷最高含量）+（該組游離蒽醌含量×20÷游離蒽醌最高含量）+（該組結合蒽醌含量×20÷結合蒽醌最高含量）。因素水平見表1。分別取何首烏200 g，按正交設計進行試驗，測定指標成分含量，結果見表2，方差分析見表3。從表2直觀分析可以看出，在所選因素水平范圍內，何首烏炮制工藝的影響因素為B>A>C，即蒸制時間>蒸制次數>曬制時間。從方差分析結果可以看出，三者均為顯著影響因素。由直觀分析結果可見，炮制次數因素各水平影響順序為A3>A2>A1，蒸制時間因素各水平影響順序為B2>B3>B1，曬制時間因素各水平影響順序為C2>C3>C1，考慮試驗時間及節省能源，將A3B2C2定為最佳炮制工藝條件，即蒸制4 h，曬制4 h，蒸曬11次。

2.3? 不同炮制品對正常人L02肝細胞活性的影響

2.3.1? 細胞培養

取正常人L02肝細胞，在37 ℃、5%CO2條件下，培養于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，待細胞密度至80%～90%時，按1∶2比例進行傳代，平均2～3 d傳一代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.3.2? 含藥培養液的制備

取何首烏生品、藥典法（2015年版《中華人民共和國藥典》）炮制品及正交試驗優選工藝炮制品粉末，過4號篩，每組樣品約20 g，精密稱量，精密加入70%乙醇120 mL，稱定質量，加熱回流0.5 h后立即冷卻，用70%乙醇補足減失的質量，過濾，濃縮并回收乙醇，濃縮液轉移至10 mL容量瓶并定容，得2 g/mL的藥液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3.3? 細胞生長抑制率測定

采用CCK-8法，將肝細胞接種于96孔板上，培養24 h后用于實驗。空白組予空白培養液，生品組予何首烏生品培養液，優選組予正交試驗優選炮制品培養液，藥典組予藥典法炮制品培養液，給藥濃度依次為40、20、10 mg/mL。每個樣品設6個復孔，周圍孔用等量PBS填充以減少邊緣效應，培養24 h后吸去培養基，PBS清洗3遍，每孔加入含CCK-8試劑10 μL的培養液100 μL，37 ℃、5%CO2繼續孵育4 h，用酶標儀測定波長450 nm處吸光度（OD值），計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）÷空白組OD值×100%。結果見表4。

3? 討論

“九蒸九曬”是中藥材傳統炮制方法，常用于何首烏、地黃、黑芝麻等炮制。“九”在古代有多種含義，除9次外，也可表示多次、長時間。本課題組查閱古代文獻，何首烏“九蒸九曬”炮制方法蒸曬次數多在7～12次，故本試驗將蒸制次數設定為5、8、11次3個水平。何首烏主要采用黑豆作為輔料進行炮制，古籍中蒸制時間多以“豆爛”“豆熟”為度，暴曬時間多以“曬干”表述，課題組前期研究表明，連續常壓蒸制2 h即可達到豆熟程度，6 h達到豆爛程度，綜合考慮選擇蒸制時間分別為2、3、4 h。另外根據實際情況，曬制4 h即可達到曬干程度，再結合古代文獻記載，選擇曬制時間為4、6、8 h。

現代研究表明，何首烏中二苯乙烯苷、蒽醌類成分對肝細胞有一定損傷作用[11-14]，這兩類成分也是《中華人民共和國藥典》何首烏質量控制的指標成分，故本研究采用該兩類成分作為考察對象。在設定的工藝參數范圍內，所有炮制品既符合傳統“九蒸九曬”炮制工藝，也符合藥典規定的質量要求。

本研究采用優選的炮制工藝和藥典方法炮制的何首烏進行正常人L02肝細胞活性實驗，結果顯示，優選炮制品的肝細胞抑制率更低，表明其對肝細胞的損傷小。結合前期化學成分研究[6]，表明二苯乙烯苷、結合蒽醌含量與肝細胞抑制率變化趨勢一致，提示這2種成分可能是何首烏肝毒性物質基礎。本課題組今后將進一步探索炮制過程-化學成分-肝毒性的關系。

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（收稿日期：2019-04-26）

（修回日期：2019-05-16;編輯：陳靜）

基金項目：國家自然科學基金（81804075）;湖南省自然科學基金（2017JJ3247）;湖南省發改委基金（[2016]518）

通訊作者：楊磊，E-mail：yanglei30@sohu.com