血漿脂氧素A4 和基質金屬蛋白酶9在早產兒支氣管肺發育不良中的預測價值

齊孟孟，徐艷，葉黎離，王軍

支氣管肺發育不良（BPD）是世界早產兒最嚴重的并發癥之一，大多數BPD發生在胎齡小于32周的嬰兒，胎齡每小1 周，BPD 的發生率即增加2～3倍［1］，與正常早產兒相比，患有BPD的嬰兒更易患呼吸系統及神經系統疾病，嚴重影響了生活質量，給家庭和社會造成了沉重的負擔。然而目前對于BPD 仍缺乏有效的治療手段，更多的集中在預防BPD 的發生上。近年來，越來越多的國內外學者熱衷于尋找BPD 的早期生物學標志物，以早期預測BPD 的發生，其中LXA4 和MMP9 已被多項動物實驗證明在肺損傷的發生和發展過程中發揮著重要的作用，但在早產兒BPD 中的研究甚少，本研究通過檢測BPD組和非BPD組早產兒生后2周不同時間點血漿LXA4 和MMP9 表達水平，探討其在早產兒支氣管肺發育不良中的變化及早期預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1—7月入住徐州醫科大學附屬醫院新生兒科的出生胎齡＜32周且住院時間超過28 d的早產兒；排除嚴重的先天性畸形、先天性遺傳代謝病，本研究征得病兒家長知情同意簽字。符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 BPD 的診斷標準 超過21%的氧氣治療時間至少28 d 的新生兒［來源于新的國立衛生研究院（美國）］［2］

1.3 標本的采集 收集病兒一般信息，包括胎齡、出生體質量、分娩方式、性別、上機時間；并于生后第1、7、14 天分別采集外周血1.5 mL，放入EDTA 抗凝管中，避免溶血，靜置30 min，然后2 000 r/min 離心15 min，分離血漿，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4 LXA4 及MMP9 的檢測 采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測兩指標，試劑盒均購自上海江萊生物有限公司。將各種試劑移至室溫（18～25 ℃）平衡20 min配制后備用，設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL；每孔加入酶標試劑100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min，棄去孔內液體甩干，洗板5次；每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μL 終止反應，在反應終止后15 min 內用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔光密度（OD值），然后計算樣本濃度。

1.5 統計學方法 所有數據經SPSS 19.0統計學軟件處理。符合正態分布的計量數據以xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。多時點觀測資料采用兩因素重復測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，時間兩兩比較采用差值t檢驗。非正態分布計量資料以中位數（上、下四分位數）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以例數（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 實驗初期共納入61例早產兒作為研究對象，其中死亡5 例，放棄3 例，嚴重先天性畸形2 例，先天性遺傳代謝病1 例，其余的50 例有20例發展為BPD，未發展為BPD的30例為非BPD組。BPD 組和非BPD 組病兒胎齡、出生體質量及孕母分娩方式差異無統計學意義（P＞0.05）；吸氧時間、最高氧濃度及機械通氣差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 血漿中LXA4表達水平變化 整體比較知：組間差異、時間差異及交互作用均差異有統計學意義（P＜0.05）。兩兩精細比較并結合主要數據分析：生后第1天BPD組和非BPD組血漿LXA4表達水平比較差異無統計學意義；隨著時間推移，BPD 組LXA4含量逐漸下降，非BPD組LXA4水平逐漸上升，于第7天達到峰值，后又逐漸下降；不同時間點兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05），病兒生后第7、14天BPD 組的LXA4 的水平低于非BPD 組，時間越長LXA4 水平越低，不同時間點兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 早產兒50例支氣管肺發育不良組與非支氣管肺發育不良組基本情況比較

表2 早產兒50例支氣管肺發育不良組與非支氣管肺發育不良組不同時間血漿LXA4水平比較/（pg/mL）

表2 早產兒50例支氣管肺發育不良組與非支氣管肺發育不良組不同時間血漿LXA4水平比較/（pg/mL）

注：整體分析為兩因素重復測量方差分析，資料球型性校正采用HF系數法；時間精細比較為差值t檢驗，顯著性標記a為和組內第1時間點比較P＜0.05；組間精細比較為LSD-t檢驗，顯著性標記b為兩組同時點相比P＜0.05。LXA4為脂氧素A4，BPD為支氣管肺發育不良

組別BPD組非BPD組整體分析組間F，P值時間F，P值交互F，P值例數20 30第1天330.4±21.6 321.1±35.9第7天281.8±7.0a 348.6±4.4ab第14天188.4±5.7a 270.3±5.4ab（HF系數：0.5225）247.875，0.000 455.125，0.000 97.468，0.000

2.3 血漿中MMP9 表達水平變化 亦經整體比較：組間差異、時間差異及交互作用均差異有統計學意義（P＜0.05）。兩兩精細比較并結合主要數據分析：生后第1 天BPD 組和非BPD 組血漿MMP9 表達水平比較差異無統計學意義。隨著時間推移，BPD組血漿MMP9含量逐漸上升，且生后第7、14天BPD 組血漿中MMP9 表達水平均高于非BPD 組，時間越長MMP9 水平越高，不同時間點之間兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 早產兒50例支氣管肺發育不良組與非支氣管肺發育不良組不同時間血漿MMP9水平比較/（ng/mL，）

表3 早產兒50例支氣管肺發育不良組與非支氣管肺發育不良組不同時間血漿MMP9水平比較/（ng/mL，）

注：同表2注。MMP9為基質金屬蛋白酶9，BPD為支氣管肺發育不良

組別BPD組非BPD組整體分析組間F，P值時間F，P值交互F，P值例數20 30第1天23.9±3.9 25.3±2.6第7天32.6±3.9a 28.8±2.9ab第14天39.0±2.1a 32.2±3.4ab（HF系數：0.9349）29.744，0.000 161.724，0.000 22.296，0.000

2.4 血漿中LXA4 和MMP9 表達水平對早產兒BPD 發生的預測價值 依據BPD 組和非BPD 組LXA4濃度繪制ROC 曲線下面積AUC 為0.670（95%可信區間為0.580～0.759），最佳診斷界值為328.454 pg/mL，其特異度為0.867，靈敏度為0.514；依據BPD組和非BPD 組MMP9 濃度繪制ROC 曲線下面積AUC 為0.749（95%可信區間為0.667～0.830），最佳診斷界值為31.643 ng/mL，其特異度為0.856，靈敏度0.633；見圖1。

3 討論

BPD 是一種嬰兒期的慢性肺病，它的發病機制是多因素的，已有的相關研究［3］表明，早產兒肺發育不成熟、吸入氧濃度過高、過長時間接觸氧氣及機械通氣，抗氧化能力缺陷以及蛋白酶抑制劑缺乏是BPD發生的獨立危險因素，炎癥是BPD多因素起源的共同特征，本研究中病兒在吸入氧濃度、用氧及機械通氣時間上差異有統計學意義，與已有的研究［4］相一致，盡管在過去幾十年中新生兒醫學取得了許多進展，如引入更好的機械通氣策略以及使用表面活性劑和產前類固醇激素，但BPD的發病率并未下降，因此早期預測BPD 的發生，并給予相應的預防和治療對BPD的進展及預后有重要的意義。

圖1 兩組指標預測早產兒BPD的ROC曲線：A為LXA4的ROC生存曲線，B為MMP9的ROC生存曲線

脂氧合酶（LXs）是花生四烯酸的重要代謝產物，能廣泛抑制多種炎性細胞的分泌和炎癥相關基因的表達，稱為炎性反應的“剎車信號”，其強大的抗炎作用涉及機體的呼吸、消化、泌尿和自身免疫等多個系統［5-6］。朱天琦與楊建平［7］通過測定細胞活力證實LXA4可以通過促進人Ⅱ型肺泡上皮細胞的損傷修復和增殖減輕急性肺損傷；李淑君等［8］通過高氧誘導構建的BPD動物模型表明LXA4可能通過抑制TGF-β1信號通路的轉導實現對高氧損傷小鼠肺上皮細胞的保護；Kumar 等［9］發現暴露于高氧環境中的小鼠體內的LXA4 表達水平降低，推測LXA4對高氧所致肺損傷有重要的保護意義。本研究中BPD 組LXA4 的表達水平較非BPD 組明顯降低，與動物及細胞模型實驗結果相一致，且本研究發現隨著時間延長，BPD 組LXA4 的表達水平越來越低，考慮可能是由于病兒出生后長時間暴露高氧環境及機械通氣引起肺部反復感染，而肺部感染又引起一系列炎癥反應，使炎癥細胞募集并激活造成肺組織和結構損傷，肺損傷又使機械通氣、氣管插管及供氧時間延長，形成惡性循環，引起抗炎因子如LXA4越來越低，這與Krishnamoorthy 等［10］發現的LXA4受體的表達水平隨著炎癥持續時間的延長而降低相一致；本研究中BPD組LXA4表達水平在第7天明顯下降，而非BPD 組LXA4 的表達水平在第7天達到最高峰，可能與其在母體獲得的不飽和脂肪酸或腸道喂養有關，在炎癥反應期間形成，然后起作用以解決炎癥反應［11］，因此生后7 d檢測LXA4表達水平對早產兒支氣管肺發育不良的早期預測有重要意義，對于可能發展為BPD 的早產兒，早期應用LXA4類似物能預防BPD的發生。

細胞外基質的沉積和重塑是肺泡形成過程中的關鍵步驟，ECM 重構與MMP9 基因、TIMP 1 基因表達增加和MMP 12 基因表達降低有關。有實驗表明，40%氧氣的長時間應用增加了MMP9 和彈性蛋白酶活性，導致彈性蛋白降解增加和肺泡出現肺氣腫，類似于BPD 的結果。Lim 等［12］實驗表明在高氧暴露后成年大鼠的II 型肺泡上皮細胞中MMP9 表達水平增高；Lee 等［13］研究發現在發展為BPD 的早產兒肺泡灌洗液或氣管抽吸物中MMP9表達水平升高；本研究中BPD 組MMP9 的表達水平較非BPD 組明顯升高，與動物實驗及既往臨床試驗結果相符，表明MMP9 在BPD 的形成過程中發揮了重要的作用；且本研究發現生后7d 內BPD組MMP9 的表達水平明顯升高，非BPD 組MMP9 的表達水平升高不明顯，隨著時間延長，BPD 組MMP9 的表達水平會越來越高，考慮可能是由于感染、機械通氣、吸入高氧等炎癥反應的初期，引起炎性細胞肺內聚集，活化的炎癥細胞釋放大量的氧自由基，導致彈性蛋白酶如MMP9 增高；而在肺纖維化啟動階段，內皮細胞、上皮細胞受損，導致炎性細胞聚集，釋放促纖維化細胞因子、生長因子，促使MMPs 的合成與活化水平更高，從而參與肺基質和基底膜的破壞［14］，導致BPD 發生，因此生后7 d 檢測MMP9 的表達水平對BPD 發生的早期預測有重要的價值。

綜上所述，LXA4 和MMP9 在BPD 早期預測中有重要的意義，根據ROC 曲線可知，當早產兒血漿中LXA4 表達水平≤328.454 pg/mL，MMP9 表達水平≥31.643 ng/mL時發展為BPD的可能性大，但靈敏度和特異度還不夠高，可能與樣本量少、檢測儀器有限等有關，仍需要大量的臨床研究進一步觀察兩者聯合檢測對BPD 的診斷價值，以及LXA4 和MMP9與不同程度BPD 之間的相關性及與BPD 預后之間的關系。