扶正化瘀方對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞M1型炎性極化JNK通路的影響

張滿　胡旭東　黃愷　陶艷艷　彭淵　劉成海

摘要：目的??觀察扶正化瘀方對脂多糖（LPS）誘導的M1型RAW264.7巨噬細胞一氧化氮合酶（iNOS）基因和一氧化氮（NO）分子過表達的影響，探討其可能的抗炎機制。方法??采用LPS刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞，建立M1型巨噬細胞炎性細胞模型，分別給予扶正化瘀方50、100、200?μg/mL和10?nmol/L?JNK蛋白抑制劑SP600125進行孵育。Griess法檢測炎癥介質NO含量，RT-PCR檢測炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和iNOS基因表達，Western?blot檢測iNOS蛋白表達和MAPK信號通路中JNK、p38、ERK蛋白的磷酸化水平。結果??與LPS比較，扶正化瘀方和SP600125均顯著降低巨噬細胞中NO分泌（P<0.01）和iNOS蛋白表達（P<0.01），降低MAPK信號通路JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05，P<0.01）;扶正化瘀方對炎癥因子IL-6、TNF-α的基因表達及MAPK信號通路ERK、p38蛋白的磷酸化水平無明顯影響。結論??扶正化瘀方可能通過抑制JNK蛋白的磷酸化而抑制iNOS基因過表達，最終減少NO的生成，從而抑制RAW264.7巨噬細胞M1型極化，發揮抗炎作用。

關鍵詞：扶正化瘀方;巨噬細胞;一氧化氮;一氧化氮合酶;MAPK信號通路;JNK信號通路

中圖分類號：R285.5????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0043-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201909314

Effects?of?Fuzheng?Huayu?Prescription?on?LPS-induced?Inflammatory?M1?Polarization?of?RAW264.7?Macrophages?Through?JNK?Pathway

ZHANG?Man1，?HU?Xudong2，?HUANG?Kai1，?TAO?Yanyan1，?PENG?Yuan1，?LIU?Chenghai1，3，4

1.?Institute?of?Liver?Diseases，?Shuguang?Hospital?Affiliated?to?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China;?2.?School?of?Basic?Medical?Sciences，?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China;?3.?Key?Laboratory?of?Liver?and?Kidney?Diseases?of?Shanghai?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Ministry?of?Education，?Shanghai?201203，?China;?4.?Shanghai?Key?Laboratory?of?Clinical?Chinese?Medicine，?Shanghai?201203，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?effects?of?Fuzheng?Huayu?Prescription?on?iNOS?gene?overexpression?and?NO?overproduction?in?M1?polarized?RAW264.7?macrophages?induced?by?lipopolysaccharide?（LPS）;?To?discuss?its?possible?anti-inflammatory?mechanism.?Methods?LPS?was?used?to?stimulate?mouse?RAW264.7?macrophages?to?establish?an?inflammatory?M1?macrophage?model，?and?Fuzheng?Huayu?Prescription?（50，?100，?200?μg/mL）?and?10?nmol/L?JNK?inhibitor?SP600125?were?incubated?respectively.?Inflammatory?mediator?NO?production?was?measured?by?Griess?method.?The?mRNA?expressions?of?inflammatory?cytokines?IL-6，?TNF-α?and?iNOS?were?detected?by?Real-time?RT-PCR.?iNOS?protein?expression?and?the?phosphorylation?levels?of?key?proteins?in?MAPK?signaling?pathway，?namely?p-JNK，?p-p38?and?p-ERK?were?detected?by?Western?blot.?Results?Compared?with?LPS，?Fuzheng?Huayu?Prescription?and?SP600125?could?significantly?reduce?the?overproduction?of?NO?（P<0.01），?the?overexpression?of

iNOS?protein?（P<0.01）?and?the?phosphorylation?levels?of?JNK?protein?（P<0.05，?P<0.01）?in?MAPK?signaling?pathway?in?macrophages.?Fuzheng?Huayu?Prescription?had?no?significant?effect?on?the?mRNA?expressions?of?inflammatory?cytokines?IL-6?and?TNF-α?in?LPS-induced?macrophages，?and?the?phosphorylation?levels?of?ERK?and?p38?proteins?in?MAPK?signaling?pathway.?Conclusion?Fuzheng?Huayu?Prescription?exerts?its?anti-inflammatory-M1?-?polarization?effect?on?RAW264.7?macrophages?through?inhibiting?iNOS?gene?overexpression?and?NO?overproduction?by?repressing?JNK?phosphorylation.

Keywords：?Fuzheng?Huayu?Prescription;?macrophage;?NO;?iNOS;?MAPK?signaling?pathway;?JNK?signaling?pathway

慢性肝病進展中，肝臟炎癥（inflammation）→纖維化（fibrosis）→癌癥（cancer）所構成的IFC軸線越來越被人們重視[1]，肝內M1型巨噬細胞炎性極化是肝纖維化發生的始動因素和肝纖維化進展的促進要素。因此，抑制肝臟中肝內M1型巨噬細胞炎性極化，從而減輕肝臟炎癥損傷，是肝纖維化乃至肝癌防治中的重要目標。扶正化瘀方由上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝病研究所研制，臨床廣泛用于抗肝纖維化。研究表明，扶正化瘀方治療慢性乙型肝炎肝纖維化6個月后，在逆轉肝纖維化的同時明顯改善肝組織炎癥[2]，但其抗炎分子機制尚未闡明。我們前期研究發現，扶正化瘀方能顯著抑制M1型巨噬細胞中炎癥介質一氧化氮（NO）生成。在M1型巨噬細胞中，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）催化L-精氨酸分解產生NO[3]，而MAPK信號通路則是調控iNOS基因表達的重要信號通路[4]。本研究擬探討扶正化瘀方通過調控MAPK信號通路減少NO生成從而抑制M1型巨噬細胞炎性極化的可能抗炎機制。

1??實驗材料

1.1??藥物

扶正化瘀方浸膏粉，上海黃海制藥有限責任公司，批號180206。質控標準：褐色粉末，味苦、澀;每克含發酵草菌粉以腺苷不少于1000?g/批，丹參以丹參素鈉不少于3000?g/批，丹酚酸B不少于5000?g/批，水分少于8.0%，需氧菌總數不超過1000?cfu/g，霉菌、酵母菌總數不超過100?cfu，大腸埃希菌不得檢出。

1.2??細胞株及主要試劑

RAW264.7巨噬細胞株，購自中國科學院干細胞庫（編號SCSP-5036）。DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國Gibco公司），鏈霉素、青霉素均（ScienCell公司），CCK8細胞試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Corning公司），脂多糖（LPS，美國Sigma公司），JNK抑制劑SP600125，（MCE公司），總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司），反轉錄試劑盒（貨號RR047A，TaKaRa公司），擴增試劑盒（貨號RR420A，TaKaRa公司），BCA蛋白定量試劑盒（貨號23227，Pierce化學公司），iNOS抗體（Abcam公司），p-JNK、p-ERK和p-p38抗體（美國CST公司），山羊抗鼠和山羊抗兔的熒光二抗（LI-COR公司），GAPDH抗體（Proteintech公司）。

1.3??儀器

Odyssey紅外熒光掃描成像系統，美國LI-COR公司;垂直板電泳槽、半干電轉印系統，美國Bio-Rad公司;ABIViiA7型熒光定量PCR儀，美國ABI公司;多功能酶標儀，美國Bio-Tek公司。

2??實驗方法

2.1??細胞培養

將RAW264.7細胞以合適的濃度接種于10?cm培養皿中，根據實驗需要接種不同數量細胞于6、96孔細胞培養皿中，置于含10%FBS?DMEM培養基，37?℃、5%O2、95%濕度培養箱中培養。傳代時吸走部分培養液，留下3～4?mL培養液，用無菌細胞刮板刮拭培養皿表面，將細胞刮落，吹打后接種到新的裝有新鮮培養液的培養皿中進行傳代。

2.2??CCK8法檢測扶正化瘀方細胞毒性

RAW264.7細胞接種至96孔板，調整細胞數量為5×104個/孔，細胞種板后，分別加入2、5、50、100、200、400、1000?μg/mL不同濃度扶正化瘀方，每個濃度設置6個復孔，將接種好的細胞置于培養箱中孵育24?h后棄去上清液，每孔加100?μL?10%?CCK8繼續培養2?h，在波長450?nm/630?nm處測吸光度，計算細胞存活率，評價扶正化瘀方的細胞毒性。

2.3??細胞分組

體外培養RAW264.7細胞接種于6孔板，根據實驗需要設計正常組、正常+扶正化瘀方組、LPS組、LPS+扶正化瘀方（50、100、200?μg/mL）組和JNK抑制劑組，每組設3個復孔。細胞種板后，LPS組和LPS+扶正化瘀方組給予1?μg/mL?LPS刺激，JNK抑制劑組給予10?nmol/L?SP600125刺激，隨后LPS+扶正化瘀方組給予不同濃度扶正化瘀方（50、100、200?μg/mL）孵育24?h。收集培養上清液和細胞備用。

2.4??Griess法檢測一氧化氮生成

0.1%N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽（以ddH2O溶解）和1%磺胺（以5%H3PO4溶解）按1∶1混合即為Griess試劑，并以NaNO2制作標準曲線。100?μL?Griess試劑與100?μL細胞上清混合，10?min后檢測OD540?nm吸光度，根據標準曲線擬合公式計算樣本中NO濃度。

2.5??RT-PCR實驗

收集細胞，加入Trizol裂解細胞，提取總RNA，反轉錄和擴增試劑盒合成cDNA和cDNA擴增。采用2-ΔΔCt法進行分析定量。以β-actin為內參，檢測巨噬細胞中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和iNOS基因的表達。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

2.6??Western?blot實驗

收集細胞后，加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑RIPA裂解液冰上裂解30?min，4?℃、12?000×g離心15?min，收取上清液。BCA法蛋白定量后進行蛋白變性、電泳、轉膜、封閉。分別加入1∶250稀釋的iNOS抗體，1∶1000稀釋的p-JNK、p-ERK和p-p38抗體，4?℃孵育一抗過夜。熒光標記的二抗室溫避光孵育60?min，Odyssey紅外成像系統掃描讀取目的條帶。以GAPDH為內參，檢測樣本中iNOS、p-JNK、p-ERK、p-p38的蛋白含量。

3??統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示，多樣本均數間比較采用ANOVA檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4??結果

4.1??扶正化瘀方對RAW264.7巨噬細胞抑制率的影響

與正常組比較，扶正化瘀方在1000??g/mL濃度時對RAW264.7巨噬細胞有顯著抑制作用，而在25～400??g/mL濃度范圍對RAW264.7細胞無明顯毒性。結果見圖1。因此，在后續實驗中選用扶正化瘀方50、100、200?μg/mL作為工作濃度。

4.2??扶正化瘀方對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞一氧化氮合酶、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α基因表達的影響

與正常組比較，LPS誘導RAW264.7巨噬細胞中炎癥相關因子iNOS、IL-6和TNF-α基因表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;與LPS組比較，扶正化瘀方各濃度組IL-6、TNF-α基因表達無明顯變化，但能明顯下調iNOS基因的表達，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），尤以扶正化瘀方200?μg/mL濃度時最為顯著，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖2。

4.3??扶正化瘀方對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞一氧化氮合酶蛋白表達和一氧化氮生成的影響

與LPS組比較，扶正化瘀方在200?μg/mL濃度時能顯著抑制iNOS蛋白表達（P<0.01）;同時呈劑量依賴性減少細胞培養上清液中的NO生成（P<0.01）。結果見圖3。

4.4??扶正化瘀方對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞MAPK信號通路活化的影響

與正常組比較，LPS刺激RAW264.7細胞可促進MAPK信號通路中p38、JNK、ERK蛋白的磷酸化，差異有統計學意義（P<0.05）;與LPS組比較，扶正化瘀方能顯著抑制JNK蛋白磷酸化（P<0.05），對p38、ERK蛋白磷酸化僅有抑制趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖4。

4.5??JNK蛋白抑制劑SP600125對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞一氧化氮合酶蛋白表達和一氧化氮生成的影響

與LPS組比較，JNK蛋白抑制劑SP600125顯著下調巨噬細胞JNK蛋白的磷酸化（P<0.05，P<0.01），同時降低巨噬細胞iNOS蛋白的表達（P<0.05）和NO的生成（P<0.01）。結果見圖5。

5??討論

扶正化瘀方由丹參、桃仁、絞股藍、松花粉、冬蟲夏草菌絲和五味子組成，廣泛應用于治療肝纖維化和肝硬化[5]。在肝纖維化和肝硬化進程中，慢性肝臟炎癥是激發肝纖維化的關鍵先決條件[6]。肝臟發生炎癥時，肝內巨噬細胞被各種體內外刺激因素激活，主要以M1型功能狀態存在，通過促炎介質進一步加重肝細胞的損傷和炎癥，同時通過分泌各種纖維生成介質激活肝星狀細胞（HSCs），從而促進肝纖維進展[7-8]。因此，通過抑制肝內巨噬細胞M1型極化從而減輕肝臟炎癥損傷、減少HSCs細胞活化，從源頭阻斷IFC軸線病理進程。本課題既往研究表明，扶正化瘀方能抑制從CCl4損傷大鼠分離培養的肝Kupffer巨噬細胞中促纖維化因子轉化生長因子-β和血小板衍生因子的表達[9]，還可通過調節Kupffer巨噬細胞旁分泌從而抑制HSCs的活化[10]。

巨噬細胞是一種機體內廣泛分布的固有免疫細胞，在炎癥和免疫過程中發揮十分重要的作用[11]。巨噬細胞可根據表型及功能變化分為促炎的M1型和抑炎的M2型[12-13]。巨噬細胞受LPS刺激后向促炎的M1型極化，細胞內iNOS基因表達增強，iNOS大量增加，從而催化精氨酸分解生成過量NO。過量NO與O2-生成的過氧化亞硝酸鹽通過強烈過氧化作用導致細胞死亡、廣泛的組織損傷和病理變化。因此治療NO參與的炎癥性疾病，iNOS基因表達和活性調控是最直接和關鍵的靶點。本研究表明，與LPS誘導的M1型巨噬細胞比較，扶正化瘀方能顯著抑制M1型巨噬細胞中NO的生成，且呈明顯劑量依賴性;同時，扶正化瘀方在濃度為200?μg/mL時顯著抑制NO關鍵合成酶iNOS的基因表達，而對IL-6、TNF-α基因表達無影響。

Toll樣受體（TLR）參與機體防御入侵病原體的第一線，在炎癥、免疫細胞調節生存和增殖中具有重要作用。TLR4受LPS刺激活化后觸發下游的MAPK信號通路，對巨噬細胞內iNOS基因的過表達具有關鍵調控作用[14]。MAPK由一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成，在被細胞外各種刺激活化后介導從細胞表面到核內的信號傳遞。在哺乳動物細胞內有3條已被明確定義的MAPK信號通路：JNK、ERK、p38。LPS和其他促炎因子能誘導MAPK信號通路相關蛋白磷酸化并進入核內，觸發核內iNOS基因表達。本實驗結果顯示，與正常組比較，LPS能顯著促進M1型巨噬細胞中JNK、ERK、p38蛋白的磷酸化，促進iNOS基因和蛋白表達以及NO產生;而扶正化瘀方對ERK、p38蛋白的磷酸化調節與LPS組比較無明顯差異，但其能顯著抑制JNK蛋白的磷酸化。進一步實驗發現，JNK蛋白表達被抑制后，細胞中iNOS蛋白表達及NO產生均被顯著抑制。上述結果表明，MAPK信號通路中的JNK蛋白可能是扶正化瘀方抑制巨噬細胞M1型炎性極化的關鍵靶點。

綜上所述，扶正化瘀方可通過抑制MAPK信號通路中JNK蛋白磷酸化減少巨噬細胞iNOS基因及蛋白過表達及NO過量生成，從而抑制巨噬細胞M1型炎性極化發揮其抗炎作用，這可能是扶正化瘀方抗炎、抗肝纖維化的分子機制之一。

參考文獻：

[1]?DING?Y?F，?WU?Z?H，?WEI?Y?J，?et?al.?Hepatic?inflammation-fibrosis-?cancer?axis?in?the?rat?hepatocellular?carcinoma?induced?by?diethylnitrosamine[J].?J?Cancer?Res?Clin?Onco，2017，143（5）：821-834.

[2]?LIU?P，?HU?Y?Y，?LIU?C，?et?al.?Multicenter?clinical?study?on?Fuzhenghuayu?capsule?against?liver?fibrosis?due?to?chronic?hepatitis?B[J].?World?J?Gastroenterol，2005，11（19）：2892-2899.

[3]?LEE?M，?REY?K，?BESLER?K，?et?al.?Immunobiology?of?nitric?oxide?and?regulation?of?inducible?nitric?oxide?synthase[J].?Results?Probl?Cell?Differ，2017，62：181-207.

[4]?SHIN?W?B，?DONG?X，?KIM?Y?S，?et?al.?Anti-inflammatory?effects?of?batillaria?multiformis?water?extracts?via?NF-кB?and?MAPK?signaling?pathways?in?LPS-induced?RAW264.7?Cells[J].?Adv?Exp?Med?Biol，2019，1155：1001-1014.

[5]?趙長青，徐列明.扶正化瘀膠囊/片治療肝纖維化和肝硬化的臨床研究進展[J].世界中醫藥，2014，9（5）：561-567.

[6]?HENDERSON?N?C，?IREDALE?J?P.?Liver?fibrosis：cellular?mechanisms?of?progression?and?resolution[J].?Clin?Sci，2007，112（5）：265-280.

[7]?FRANK?T.?Targeting?hepatic?macrophages?to?treat?liver?diseases[J].?Journal?of?Hepatology，2017，66（6）：1300-1312.

[8]?PRADERE?J?P，?KLUWE?J，?MINICIS?S?D，?et?al.?Hepatic?macrophages?but?not?dendritic?cells?contribute?to?liver?fibrosis?by?promoting?the?survival?of?activated?hepatic?stellate?cells?in?mice[J].?Hepatology，2013，58（4）：1461-1473.

[9]?姜春萌，劉成，劉成海，等.扶正化瘀方對大鼠CCl4損傷肝Kupffer細胞功能的影響[J].中西醫結合肝病雜志，2000，10（5）：26-28.

[10]?LIU?C，?HU?Y，?XU?L，?et?al.?Effect?of?Fuzheng?Huayu?formula?and?its?actions?against?liver?fibrosis[J].?Chin?Med，2009，4：12.

[11]?YU?Y，?SHEN?M，?WANG?Z，?et?al.?Sulfated?polysaccharide?from，?Cyclocarya?paliurus，?enhances?the?immunomodulatory?activity?of?macrophages[J].?Carbohydrate?Polymers，2017，174：669-676.

[12]?WYNN?T?A，?CHAWLA?A，?POLLARD?J?W.?Macrophage?biology?in?development，?homeostasis?and?disease[J].?Nature，2013，496（7446）：445-455.

[13]?VINOGRADOV?S，?WARREN?G，?WEI?X.?Macrophages?associated?with?tumors?as?potential?targets?and?therapeutic?intermediates[J].?Nanomedicine?（Lond），2014，9（5）：695-707.

[14]?PENG?X?X，?ZHANG?S?H，?WANG?X?L，?et?al.?Panax?Notoginseng?flower?saponins?（PNFS）?inhibit?LPS-stimulated?NO?overproduction?and?iNOS?gene?overexpression?via?the?suppression?of?TLR4-mediated?MAPK/NF-к?B?signaling?pathways?in?RAW264.7?macrophages[J].?Chin?Med，2015，10：15.

（收稿日期：2019-09-23）

（修回日期：2019-10-11;編輯：華強）