電針對不同階段SAMP8小鼠學習記憶能力及海馬區突觸素和突觸后致密物-95表達的影響

趙恩聰　鄭家勇　郭婉清　洪苗苗　林嵐　王豐　董衛國

摘要：目的??觀察電針對不同階段SAMP8小鼠學習記憶能力及海馬區突觸素（SYN）和突觸后致密物-95（PSD-95）表達的影響，探討電針治療阿爾茨海默病的最佳時機。方法??SAMP8小鼠48只隨機分成模型組、3月齡電針組、6月齡電針組和9月齡電針組，每組12只，同齡正常老化SAMR1小鼠12只為對照組。電針組均選取“百會”“大椎”“腎俞”，電針頻率為2?Hz，每日1次，8?d為1個療程，每個療程間隔2?d，共3個療程。運用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力，免疫組化和Western?blot檢測海馬突觸相關蛋白SYN和PSD-95的表達。結果??與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，原平臺象限停留時間明顯縮短，跨越原平臺次數明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01），海馬區SYN和PSD-95蛋白表達明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，各電針組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，原平臺象限停留時間明顯延長，跨越原平臺次數明顯增加，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01），海馬區SYN和PSD-95蛋白表達均明顯升高（P<0.01），且均以3月齡電針組最顯著（P<0.05，P<0.01）。結論??電針能提高SAMP8小鼠學習記憶能力，促進海馬區SYN、PSD-95蛋白的表達，改善突觸功能。

關鍵詞：阿爾茨海默病;電針;學習記憶;突觸素;突觸后致密物-95;SAMP8小鼠

中圖分類號：R245????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0048-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908294

Effects?of?Electroacupuncture?on?Learning?and?Memory?Ability?and?Expressions?of?Hippocampal?Synaptophysin?and?PSD-95?in?SAMP8?Mice?at?Different?Stages

ZHAO?Encong1，?ZHENG?Jiayong2，?GUO?Wanqing3，?HONG?Miaomiao1，?LIN?Lan4，?WANG?Feng4，?DONG?Weiguo4

1.?College?of?Acupuncture?and?Moxibustion，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China;?2.?College?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China;?3.?The?Third?Peoples?Hospital?of?Fujian?Province，?Fuzhou?350108，?China;?4.?College?of?Integrated?Chinese?and?Western?Medicine，?Fujian?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Fuzhou?350122，?China

Abstract：?Objective?To?observe?the?effects?of?electroacupuncture?on?learning?and?memory?ability?and?expressions?of?synaptophysin?（SYN）?and?postsynaptic?density-95?（PSD-95）?in?the?hippocampus?of?SAMP8?mice?at?different?stages;?To?explore?the?optimal?time?of?electroacupuncture?in?the?treatment?of?Alzheimer?disease?（AD）.?Methods?Totally?48?SAMP8?mice?were?randomly?divided?into?model?group，?3-month-old?electroacupuncture?group，?6-month-old?electroacupuncture?group?and?9-month-old?electroacupuncture?group，?with?12?mice?in?each?group.?12?SAMR1?mice?of?the?same?age?and?normal?aging?were?set?as?control?group.?In?the?electroacupuncture?group，?Baihui?（GV20），?Dazhui?（GV14）?and?Shenshu?（BL23）?acupoints?were?selected.?The?electroacupuncture?frequency?was?2?Hz，?once?a?day，?and?8?days?was?a?course?of?treatment，?with?a?course?interval?of?2?days.?There?were?3?courses?of?treatment?in?total.?Morris?water?maze?experiment?was?used?to?test?the?learning?and?memory?ability?of?mice?in?each?group，?and?the?expression?of?hippocampal?synapse?related?proteins?SYN?and?PSD-95?was?measured?by?immunohistochemistry

and?Western?blot.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?escape?latency?of?the?model?group?was?significantly?prolonged，?the?residence?time?of?the?original?platform?quadrant?was?significantly?shortened，?and?the?number?of?crossing?the?original?platform?was?significantly?reduced，?with?statistical?significance?（P<0.05，?P<0.01）.?The?expression?of?SYN?and?PSD-95?protein?in?hippocampus?of?model?group?significantly?decreased?（P<0.01）.?Compared?with?the?model?group，?the?escape?latency?of?the?mice?in?each?electroacupuncture?group?was?significantly?shortened，?the?residence?time?of?the?original?platform?quadrant?was?significantly?prolonged，?and?the?number?of?crossing?the?original?platform?significantly?increased，?with?statistical?significance?（P<0.05，?P<0.01）.?The?expressions?of?SYN?and?PSD-95?protein?in?hippocampus?of?mice?in?each?electroacupuncture?group?significantly?increased?（P<0.05，?P<0.01），?and?were?most?significant?in?the?3-month-old?electroacupuncture?group?（P<0.01）.?Conclusion?Electroacupuncture?can?improve?the?learning?and?memory?ability?of?SAMP8?mice，?promote?the?expressions?of?SYN?and?PSD-95?in?the?hippocampus，?and?improve?the?synaptic?function.

Keywords：?Alzheimer?disease;?electroacupuncture;?learning?and?memory;?synaptophysin;?postsynaptic?density-95;?SAMP8?mice

阿爾茨海默?。ˋlzheimer?disease，AD）是一種起病隱匿且與年齡相關的退行性神經系統疾病，主要表現為進行性認知功能退化、記憶喪失和行為障礙等。其早期突出的病理特征為神經元的丟失與突觸損傷[1-2]。近年來，突觸功能在AD防治中備受重視，保持突觸的穩態平衡可能是AD治療的新策略[3]。研究表明，電針能增強SAMP8小鼠突觸功能[4-5]，但目前關于電針治療AD時機的研究報道較少。故本實驗對3、6、9個月不同月齡SAMP8小鼠進行電針治療，運用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力，免疫組化和Western?blot檢測與突觸可塑性密切相關的突觸素（synaptophysin，SYN）和突觸后致密物-95（postsynaptic?density-95，PSD-95）的表達，從突觸可塑性角度探討電針治療AD的時機。

1??實驗材料

1.1??動物

SAMP8小鼠48只及SAMR小鼠12只，3月齡，雄性，體質量20～25?g，北京大學醫學部（實驗動物科學部），動物許可證號SCXK（京）2011-0012。飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物實驗室，小鼠購入后均適應性飼養1周，溫度22～24?℃，相對濕度50%～60%，明暗周期12?h，自由攝食飲水。實驗過程嚴格按國際動物保護及使用指南進行，按實驗動物3R原則給予人道關懷。

1.2??主要試劑與儀器

兔單克隆抗體SYN（批號ab32127），Abcam公司;兔多克隆抗體PSD-95（批號18258），Abcam;β-actin（批號20536-1-AP），Proteintech公司;生物素標記的羊抗兔IgG、DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司;Motic?Med?6.0數碼醫學圖像分析系統，Bio-Rad圖像分析系統。G6805-Ⅰ電針治療儀，青島鑫升實業有限公司;0.25?mm×15?mm華佗牌無菌針灸針，蘇州醫療用品廠有限公司。

2??實驗方法

2.1??分組及干預

將48只SAMP8小鼠隨機分為模型組、3月齡電針組、6月齡電針組和9月齡電針組，每組12只，另取12只SAMR1小鼠作為對照組。電針組采用自制網兜固定小鼠，選取“百會”“大椎”“腎俞”，參照《實驗針灸學》[6]取穴?！鞍贂蔽挥谛∈箜敼钦校按笞怠蔽挥诒巢康?頸椎與第1胸椎間，“腎俞”位于第2腰椎下兩旁。操作方法：“百會”向前斜刺2?mm，“大椎”向下斜刺2～3?mm，“腎俞”稍向內斜刺3～4?mm，其中“大椎”“腎俞”給予電針刺激，“腎俞”雙側隔日交替。連續波，頻率2?Hz，電流強度以引起小鼠后肢肌肉輕微顫動而不嘶叫為宜。每次20?min，每日1次，8?d為1個療程，每個療程間隔2?d，共3個療程。全部小鼠由3月齡飼養至9月齡，模型組和對照組除不進行電針治療，其余抓取和固定方式相同，水迷宮實驗后統一取材。

2.2??Morris水迷宮實驗

治療結束后，均在10月齡運用Morris水迷宮視頻分析系統檢測小鼠空間學習記憶能力。定位航行實驗：將平臺置于第三象限中間，水面高于平臺約1?cm，分別從4個象限筒壁中點放入小鼠，記錄小鼠90?s內找到平臺時間，即為逃避潛伏期，連續記錄5?d。空間探索實驗：第6日撤掉平臺，將小鼠從第一象限放入，記錄90?s內小鼠跨越原平臺時間及次數。

2.3??免疫組化檢測突觸素和突觸后致密物-95蛋白表達

每組取6只小鼠，麻醉后灌流固定。取全腦修塊后放入4%多聚甲醛內，固定24～48?h。將腦組織石蠟包埋，切片，制片。分別加入SYN抗體（1∶700）和PSD-95抗體（1∶200），濕盒孵育過夜。加入生物素標記的羊抗兔IgG二抗，DAB顯色，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察每張玻片海馬CA1區3個陽性染色區域，以棕黃色作為陽性判斷標準，在同一光源、光圈、色彩飽和度和對比度等相同條件下，拍照采集圖片。用Motic?Med?6.0數碼醫學圖像分析系統對海馬CA1區SYN及PSD-95圖片進行分析，計算SYN及PSD-95的平均光密度（MOD）值。

2.4??Western?blot檢測突觸素和突觸后致密物-95蛋白表達

每組取6只小鼠進行麻醉，灌注后快速斷頭取腦，分離出完整海馬，-80?℃保存，稱海馬濕重，裂解后取上清液，BCA法測上清液濃度。蛋白樣品用10%SDS-PAGE進行電泳，300?mA轉蛋白質至PVDF膜上。封閉2?h后，加入SYN抗體（1∶8000）、PSD-95抗體（1∶1000）、抗小鼠β-actin（1∶1000），4?℃孵育過夜，TBST洗滌;加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10?000），室溫孵育2?h，TBST洗滌。配制顯色液并覆PVDF膜1?min后進行圖像掃描，Bio-Rad圖像分析系統分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對灰度。

3??統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示，水迷宮定位航行空間探索結果采用重復測量方差分析，其他結果采用方差分析，組間比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統計學意義。

4??結果

4.1??Morris?水迷宮實驗結果

與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長，原平臺象限停留時間明顯縮短，跨越原平臺次數明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，各電針組逃避潛伏期縮短，原平臺象限停留時間延長，跨越原平臺次數增加，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與9月齡電針組比較，6月齡電針組逃避潛伏期縮短，原平臺象限停留時間延長，跨越原平臺次數增加（P<0.05）;與6月齡電針組比較，3月齡電針組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺象限停留時間明顯延長，跨越原平臺次數明顯增加（P<0.05，P<0.01）。結果見圖1、表1和表2。

4.2??免疫組化染色結果

SYN主要表達于海馬CA1區神經元細胞膜、細胞質，PSD-95主要表達于神經元細胞膜。與對照組比較，模型組小鼠SYN和PSD-95陽性表達均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）;與模型組比較，各電針組MOD值均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），且3月齡電針組MOD值明顯高于6月齡和9月齡電針組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖2～圖4。

4.3??Western?blot檢測結果

與對照組比較，模型組小鼠SYN和PSD-95蛋白表達顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，各電針組小鼠SYN和PSD-95蛋白表達均明顯升高（P<0.05，P<0.01），且3月齡電針組SYN與PSD-95表達量明顯高于6月齡和9月齡電針組（P<0.01）。結果見圖5。

5??討論

AD屬中醫學“癡呆”“呆證”范疇，其病機為腎精虧虛、髓海不足、腦失所養，治療以補腎益髓、開竅醒腦為主?！夺t經精義》云：“事物之所以不忘，賴此記性，記在何處，則在腎精。益腎生精化為髓而之于腦中?！薄夺t林改錯·腦髓說》述：“小兒無記性者，腦髓未滿;年高無記性者，腦髓漸空。”均明確指出腎精化髓、髓上輸腦是記憶的物質基礎?！峨s病源流犀燭》有“督脈為精氣升降之道路”，故督脈是腎氣精微輸布于腦的關鍵通道，具有調節機體意志精神和增強思維活動的重要作用。百會屬督脈，深處為腦，有益智健腦、開竅醒神之功。大椎為督脈要穴，又與手足六陽經交會，具有通督開竅、振陽升清、調神醒腦的功效。腎俞屬足太陽膀胱經，相表里于足少陰腎經，可補腎益髓、益氣調督。百會、大椎、腎俞三穴配伍，以達醒腦開竅、益腎調督之效。研究表明，針刺“百會”“腎俞”能有效減少AD模型老年斑聚集，益腎調督法可調節炎癥因子失衡狀態，有效改善AD炎癥反應[7-8]。上述文獻與課題組前期研究[4-5，9]均證實益腎調督法對AD有良好療效。

研究表明，AD早期出現的認知障礙與突觸功能受損及突觸丟失密切相關[2，10]。SYN是一種特異性存在于突觸囊泡膜上的鈣結合糖蛋白，可反映突觸的分布和密度，SYN磷酸化可影響突觸功能，SYN通過調節軸突和樹突的分化及生長，影響突觸結構，是研究突觸可塑性的重要指標。PSD-95是突觸后膜致密區上一種支架蛋白。PSD-95可簇集谷氨酸受體和NMDA受體，影響遞質傳遞，同時還參與突觸的連接和維持，進而影響突觸可塑性。突觸是信息傳遞的樞紐及功能蛋白的密集之地。突觸可塑性是神經可塑性最主要的形式，是學習和記憶的神經生物學基礎。姚柏春等[10]發現，Aβ可誘導大鼠海馬SYN含量減少，隨之突觸密度和突觸聯系也出現下降，進而導致遞質傳遞發生障礙。Migaud等[11]研究顯示，小鼠PSD-95基因被敲除后，其大腦神經元突觸長時程增強作用發生變化，小鼠學習記憶出現功能性障礙。可見，海馬SYN、PSD-95蛋白表達水平與突觸可塑性關系密切。

本研究以快速老化模型小鼠亞系SAMP8小鼠為AD模型，設計3月齡、6月齡、9月齡電針組，分別代表AD早期、中期、晚期3個階段。SAMP8模型廣泛用于AD研究，其特點是4～5月齡開始出現認知損害及行為異常，6月齡SAMP8小鼠腦內海馬區即有大量Aβ異常沉積，并隨月齡增加損傷進一步加重[12]。本實驗結果顯示，各電針組均能上調SYN和PSD-95蛋白的表達，提示電針能增強突觸功能，這可能是改善SAMP8小鼠學習記憶能力的機制。且電針治療越早，海馬SYN、PSD-95表達水平越高，提示電針對AD的改善程度與治療時機相關，早期療效優于中期和晚期。

中醫“治未病”思想源于《黃帝內經》，形成于《傷寒雜病論》。對AD診治的指導思想是“疾病未生、疾病未發”之時，本質與現代醫學“早預防、早診斷、早治療”的原則相統一。2011年提出的NIA-AA標準，將AD分為3個階段，即無癥狀臨床前AD階段、癡呆前有癥狀階段及癡呆階段[13]。臨床事實證明，一旦AD進入輕度認知損害階段，就會發生不可逆轉的認知損害，只有早于輕度認知損害階段疾病干預才有價值[14]。本實驗結果顯示，3月齡即早期電針組治療AD療效最優，此結果契合中醫“治未病”理論。

綜上所述，AD早期電針介入能明顯改善SAMP8小鼠學習記憶能力，提高海馬SYN、PSD-95蛋白的表達水平，改善突觸功能，其療效優于AD中、晚期電針治療。這一結果為電針治療AD時機的選擇提供了思路，而關于早期介入電針療效優于中、晚期的作用機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2019-08-20）

（修回日期：2019-09-20;編輯：華強）