基于網絡藥理學探討丹參飲治療糖尿病心肌病的分子機制

楊金偉　趙燦　吳勇軍　劉秀　喻嶸

摘要：目的??采用網絡藥理學方法探討丹參飲治療糖尿病心肌病的化學成分、作用靶點及可能作用機制。方法??應用TCM?database@Taiwan、Chemistry?Database、HIT及Batman-TCM數據庫獲取丹參飲的化學活性成分及相關靶點信息，通過對比CTD及Gencards數據庫，歸納丹參飲化學成分中明確對糖尿病心肌病具有治療作用的靶基因，構建成分-靶點網絡圖。綜合藥物-疾病靶基因，使用String10.5構建靶點相互作用網絡，使用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進行拓撲分析，對丹參飲關鍵化學成分及靶基因進行評價。通過DAVID6.8數據庫對靶點基因功能進行富集分析，通過KEGG通路分析獲得參與的相關作用通路。結果??篩選得到丹參飲中91種化學成分和924個靶點對糖尿病心肌病有明確治療作用，成分-靶點網絡圖顯示成分與疾病靶點可能通過ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A等關鍵基因，經由神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等通路發揮治療作用。結論??丹參飲通過多種藥物化學成分及靶點效應有效干預糖尿病心肌病，分析成分、靶點及通路的相互關系可為進一步實驗及臨床研究提供基礎。

關鍵詞：網絡藥理學;丹參飲;糖尿病心肌病;潛在靶點

中圖分類號：R259.872;R285.5????文獻標識碼：A????文章編號：1005-5304（2020）03-0078-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812376

Discussion?on?Molecular?Mechanism?of?Danshen?Decoction?on?Diabetic?Cardiomyopathy?Based?on?Network?Pharmacology

YANG?Jinwei，?ZHAO?Can，?WU?Yongjun，?LIU?Xiu，?YU?Rong

Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?chemical?components，?targets，?and?potential?mechanism?of?Danshen?Decoction?in?treating?of?diabetic?cardiomyopathy?based?on?network?pharmacology.?Methods?The?TCM?database@Taiwan，?Chemistry?Database，?HIT?and?Batman-TCM?database?were?used?to?obtain?information?about?chemical?active?components?and?targets?of?Danshen?Decoction.?By?comparing?the?CTD?and?Gencards?databases，?the?target?genes?that?had?a?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?the?chemical?components?of?Danshen?Decoction?were?concluded.?A?component-target?network?map?was?constructed，?and?the?core?target?interaction?network?was?screened.?The?drug-disease?target?genes?were?synthesized，?and?the?String10.5?was?used?to?construct?a?target?interaction?network.?Network?Analyzer?tool?of?Cytoscape3.6.1?software?was?used?for?topological?analysis?to?evaluate?the?key?chemical?components?and?target?genes?of?Danshen?Decoction.?The?gene?function?enrichment?was?analyzed?with?DAVID6.8?database，?and?the?relevant?metabolic?pathways?were?analyzed?through?the?KEGG?pathway?analysis.?Results?Totally?91?chemical?components?and?924?targets?with?confirmed?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?Danshen?Decoction?were?obtained?after?screening.?The?component-target?network?map?showed?that?components?and?disease?targets?may?pass?key?genes?such?as?ADH1C，?SCN10A，?RYR3，?MED1?and?SCN5A，?via?neuroactive?ligand-receptor?interactions，?calcium?signaling?pathways，?cAMP?signaling?pathways，?cholinergic?synapses?and?proteoglycans?in?cancer?to?play?an?intervention?in?the?treatment?of?diabetic?cardiomyopathy.?Conclusion?The?same?and?different?chemical?components?and?target?effects?exist?between?Danshen?Decoction?effectively?interfere?with?diabetic?cardiomyopathy，?and?analyzing?the?relationship?between?components，?targets?and?pathways?can?provide

a?basis?for?further?experiments?and?clinical?applications.

Keywords：?network?pharmacology;?Danshen?decoction;?diabetic?cardiomyopathy;?potential?targets

糖尿病心肌病（diabetic?cardiomyopathy，DCM）是糖尿病并發的特異性心肌病，表現為心肌肥厚、心肌纖維化，進一步影響心肌收縮舒張功能，常并發心力衰竭及心律失常[1]。DCM發生發展過程中存在多因素共同介導，糖脂代謝失衡、氧化應激及炎癥反應、心肌細胞的凋亡、心肌纖維化等參與DCM的進程[2-3]。調節血管內環境穩態、改善微循環及保護心肌細胞是治療關鍵[4]。中藥存在復雜化學架構，多組分、多靶點協同作用，用于DCM辨證治療具有明顯優勢。《時方歌括》有“丹參飲，治心痛、胃脘諸痛多效”。丹參飲由丹參、砂仁、檀香3味藥組成。大鼠體內實驗顯示，丹參飲具有保護心肌、維持血管內皮完整抑制血小板聚集、抗炎、抗脂質過氧化和清除自由基等多種藥理作用[5]。臨床研究表明，丹參飲可緩解DCM患者臨床癥狀，改善心肌細胞功能，提高綜合治療的有效性[6]。通過研究其藥效物質基礎，發現作用靶點，可進一步闡明其作用機制。網絡藥理學整合藥物、靶點與疾病間相互作用的關聯性，從整體視角解析中藥與機體之間的作用關系，通過構建成分-靶點-疾病網絡圖，可系統并可視化多成分與多靶點之間的相互作用[7]。本研究運用網絡藥理學方法構建丹參飲的主要化學成分-靶點網絡，發現藥物與疾病對應的作用靶點，明確丹參飲治療DCM的潛在分子機制，為進一步實驗及臨床研究提供依據。

1??資料與方法

1.1??化學成分收集

以丹參飲組成藥物丹參、砂仁、檀香作為關鍵詞，通過中藥化學數據庫TCM?database@Taiwan（http：//?tcm.cmu.edu.tw/）[8]、化學專業數據庫Chemistry?Database（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及中草藥活性成分數據庫HIT（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）[9]?收集丹參飲主要化學成分，建立數據集。

1.2??潛在靶點預測

應用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-?tcm/）分析平臺[10]，在線提交丹參飲各單味藥化學成分信息，獲得與丹參飲可能作用靶點，以高可信度的蛋白作為靶點提取標準（Prediction?Score?cutoff>20）。使用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，通過輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點校正為其官方名稱（official?symbol），經上述數據庫檢索和轉化操作，獲取與活性成分相關的靶點信息[11]。

1.3??疾病靶點篩選

CTD數據庫（http：//ctdbase.org/）提供關于化學-基因/蛋白質相互作用、化學疾病和基因-疾病關系的信息[12]。Gencards數據庫（https：//www.genecards.org/）是整合詳細的人類基因信息（包括基因組、轉錄組、蛋白質組學、遺傳、臨床和功能信息）[13]。以“diabetic?cardiomyopathy”為關鍵詞，通過對比CTD、Gencards數據庫，歸納對DCM具有治療作用的靶點。

1.4??成分-靶點網絡構建

將上述化學成分和靶點數據信息，剔除無對應靶點的化學成分及重復靶點后，導入Cytoscape3.6.1（https：//cytoscape.org/），構建丹參飲化學成分-靶點網絡，并使用String10.5（https：//string-db.org/）構建靶點相互作用網絡，對靶點網絡進行拓撲分析，探究成分與潛在靶點在其系統層面的復雜關系[14]。

1.5??網絡拓撲分析

運用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進行拓撲分析。通過計算網絡中各節點和邊的拓撲特征值，包括節點連接度（betweenness?centrality）及介度（degree），對丹參飲關鍵化合物及靶點進行評價。

1.6??基因富集分析

DAVID6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）為大規模的基因或蛋白列表提供系統綜合的生物功能注釋信息[15]。將篩選得到的干預DCM作用靶點導入DAVID6.8數據庫，限定物種為人，對靶點進行基因富集分析，通過KEGG通路分析獲得參與的相關通路，從分子生物學角度闡釋丹參飲治療DCM的作用機制。

2??結果與分析

2.1??有效成分及靶點

共篩選得到丹參飲治療DCM的化學成分91個、靶點924個，其中丹參成分和靶點分別為37、646個，砂仁成分和靶點分別為37、446個，檀香成分和靶點分別為20、513個。

2.2??成分-靶點網絡

丹參飲成分-靶點網絡見圖1，包括2150個節點（94個化合物節點、2056個靶點節點）和5415條邊，每條邊表示化合物分子與靶點之間的相互作用關系。丹參飲治療DCM的靶點相互作用網絡見圖2，包括557?個節點和6488條邊，平均節點度為23.3。

注：紅色、紫色、黃色節點分別表示丹參飲中丹參、檀香、砂仁的化合物分子，藍色節點表示藥物靶點

圖1??丹參飲治療DCM化學成分-靶點網絡

圖2??丹參飲治療DCM靶點相互作用網絡

2.3??靶點網絡拓撲分析

節點連接度表示網絡中與該節點相連路線的條數，連線較多的節點在整個網絡中起樞紐作用，可能是關鍵的化合物或靶點。丹參飲治療DCM靶點相互作用網絡中前15位靶點拓撲屬性見表1。前5位靶點為ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A，分別與13、12、12、11、11個化合物發生相互作用。

表1??丹參飲治療DCM靶點拓撲屬性分析（前15位）

2.4??靶點基因富集分析

對丹參飲治療DCM的有效成分靶點進行基因富集分析，結果見表2、圖3。丹參飲治療DCM參與的通路包括神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，表明丹參飲有效成分可能通過作用這些靶點所在的信號通路發揮治療DCM作用。

表2??丹參飲治療DCM靶點參與的KEGG通路分析

圖3??丹參飲治療DCM相關靶點-通路

3??討論

DCM是一種獨立于糖尿病大血管并發癥的心肌結構和功能改變的疾病，其早期癥狀隱匿，進展性心肌細胞損害持續存在，后期易致糖尿病患者致命性心力衰竭[16]。心肌細胞凋亡及心肌間質纖維化是DCM發生發展的重要病理改變[17]。DCM病理機制包括糖、血脂代謝異常對心肌細胞損害;細胞內Ca2+穩態失常影響心肌細胞舒張和收縮功能異常;心臟自主神經病變引起心率以及血流動力學發生異常的病理改變;腎素-血管緊張素系統的激活觸發心肌肥厚，并導致心功能不全的發生;胰島素抵抗心肌細胞的糖代謝效率，導致心臟的功能障礙等[18-19]。目前臨床對DCM的藥物治療主要以延緩心肌損傷、改善心肌代謝為主，難以修復受損心肌。中藥對DCM的早期治療及患者癥狀改善有明顯優勢。丹參飲具有活血祛瘀、理氣止痛功效，廣泛應用于心血管疾病的治療。研究表明，丹參飲可通過調節糖脂代謝，下調心肌血小板反應蛋白-1、轉化生長因子-β1表達水平，減輕DCM大鼠心肌纖維化，顯著延緩高血糖大鼠DCM進程[20]。

本研究通過對丹參飲進行網絡藥理學分析，對復方中單味藥物進行化學成分和相應的靶點基因進行篩選，綜合DCM相關靶基因信息，構建了成分-靶點網絡。其中丹參平均靶點數目為49個，每個靶點平均與3種化合物相互作用;檀香平均靶點數目為51個，每個靶點平均與3種化合物相互作用;砂仁平均靶點數目為69個，每個靶點平均與4種化合物相互作用。單個化學成分可有多個靶點作用效應，同時，不同化學成分在同一靶點上也有交集，體現了中藥作用靶點廣泛、途徑多樣、功能豐富的特點。化合物靶點網絡中的關鍵靶點包括ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A。ADH1C是成熟肝細胞所特有的基因表達，可氧化腸道微生物產生內源性乙醇，氧化類固醇和膽汁酸[21]。MED1作為PPARs等核受體和轉錄因子的激活子，可調控細胞代謝、增殖及分化，在肝臟中亦有明顯表達[22]。調節ADH1C表達可促進肝臟糖異生和糖分解平衡，而MED1可提升胰島素敏感性，使葡萄糖耐受性增加。碳水化合物在體內過程富余時，多余的能量則轉化為脂肪酸，以三酰甘油和膽固醇的形式儲存于脂肪組織。ADH1C將乳糜顆粒加工成游離的脂肪酸和三酰甘油，促進轉運，穩定血脂狀態。MED1具有氧化脂肪酸的能力，減少極低密度脂蛋白含量。丹參飲通過調節二者在肝臟中特異性表達，調節糖脂代謝水平，截斷DCM進程。人基因組中存在11種編碼電壓門控鈉離子通道（voltage-gated?sodium?channel，VGSC）α亞單位的基因。SCN5A編碼的Nav1.5對心臟組織中的鈉離子通道有特異性作用，在心肌細胞及特化的心臟傳導系統中均大量表達。SCN10A同樣在心臟電生理中有重要作用，與心肌傳導系統功能和多種心律失常密切相關[23]。丹參飲可干預SCN5A及SCN10A調節心肌細胞功能狀態和電生理過程，達到治療DCM的效應。丹參飲靶向細胞內鈣信號通道基因RyR3，可影響Ca2+信使作用，調節機體神經遞質釋放、細胞增殖與凋亡，在小腸黏膜上皮細胞中的穩態效應可以促進葡萄糖吸收，維持心肌細胞的正常收縮舒張功能[24]。KEGG通路主要涉及神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，由此推測丹參飲的有效成分可能通過作用于上述信號通路達到治療DCM的目的。其中神經活性配體-受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體配體的集合，與神經功能關系最為密切。電生理活動和機械運動是心臟的基本活動形式，心肌細胞代謝障礙、自主神經功能紊亂、胰島素抵抗及細胞因子等都參與了DCM的發生發展。在DCM病理狀態下，心臟電生理活動出現障礙及紊亂，進而影響心臟的泵血功能，引起血流動力學異常[25]。而心肌細胞外葡萄糖水平升高直接引起鈣穩態失調，通過鈣信號通路影響胞內鈣離子轉運，降低肌膜上的Na+-K+-ATP酶及肌漿網Ca2+-ATP酶活性，造成鈣離子超載，導致心肌細胞損傷，心肌舒張期延長。細胞胞膜受損，肌動蛋白對外周鈣離子濃度敏感性下降，引起心室收縮功能障礙[26]。cAMP是細胞內重要的第二信使，經由PKA磷酸化信號轉導途徑中靶點調控細胞代謝功能，與血壓、心率及心肌收縮等心血管功能密切相關[27]。抑制心肌細胞內cAMP蓄積，可減少心肌耗氧量，緩解過度激素及神經遞質釋放造成的心肌組織損傷，維持心肌正常不應期狀態，防止心率失常的發生。上述研究均佐證了網絡藥理學分析結果。

本研究基于網絡藥理學分析藥物與疾病靶點的相互作用關系，明確了丹參飲有效成分及其治療DCM潛在作用靶點，并通過KEGG通路分析闡釋其信號通路及分子機制，可為丹參飲干預DCM的臨床應用提供依據，為后續機制研究提供思路和方法。

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（收稿日期：2018-12-29）

（修回日期：2019-01-30;編輯：陳靜）