化痰散結方含藥血清體外抗胃癌作用

王華 郭維 孫琪

【摘要】 目的：研究化痰散結方含藥血清對胃癌細胞株增殖抑制作用。方法：以MGC803和MKN45胃癌細胞株為研究對象，加入化痰散結方含藥血清，CCK-8法檢測化痰散結方含藥血清對2種胃癌細胞株增殖抑制作用。結果：化痰散結方含藥血清對MGC803和MNK45胃癌細胞均具有抑制作用，其中對MGC803胃癌細胞最佳干預濃度為20%，最佳干預時間為48 h;對MKN45胃癌細胞最佳干預時間為72 h，最佳干預濃度為20%。結論：化痰散結方含藥血清對胃癌細胞株的增殖具有抑制作用，為后期開展實驗研究奠定基礎。

【關鍵詞】 化痰散結方 含藥血清 胃癌細胞增殖

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.07.003??文獻標識碼 A??文章編號 1674-6805（2020）07-000-03

Anti-gastric Cancer Effect in Vitro of Huatan Sanjie Prescription Containing Drug Serum/WANG Hua， GUO Wei， SUN Qi. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（7）： -8

[Abstract] Objective： To study the inhibitory effect of Huatan Sanjie Prescription on proliferation of gastric cancer cell lines. Method： The MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines were taken as the research object， adding Huatan Sanjie Prescription containing drug serum， and the CCK-8 method was used to detect the effect of Huatan Sanjie Prescription containing drug serum on the proliferation inhibition of the two gastric cancer cell lines. Result： The Huatan Sanjie Prescription containing drug serum had cytotoxic effects on both MGC803 and MKN45 gastric cancer cell lines. The optimal intervention concentration for gastric cancer cells of MGC803 was 20% and the optimal intervention time was 48 h， for MKN45 gastric cancer cells， the optimal intervention time was 72 h and the optimal intervention concentration was 20%. Conclusion： The serum containing Huatan Sanjie Prescription has inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cell lines， which laid a foundation for the later experimental research.

[Key words] Huatan Sanjie Prescription Containing drug serum Cell proliferation in gastric cancer

First-authors address： Traditional Chinese Medicine School of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China

胃癌（gastric cancer，GC）是在亞洲地區常見的消化道腫瘤，因其侵襲和轉移致患者預后極差，死亡率很高[1]。因此，增加對GC發病和進展的理解，可能有助于改善臨床和治療。中醫認為，痰濁與胃癌的發病有密切關系。痰的特點是膠著難去，隨氣升降，無處不到[2-3]，其特點與腫瘤的特性十分相似。《丹溪心法》曰：“凡人身，上中下有塊者，多是痰。”這也充分說明痰與腫瘤的關系[4]。基于此理論，化痰法治療腫瘤成為臨床常用的一種大法，本課題組前期自擬化痰散結方治療胃癌，取得較好的療效，進一步從基礎實驗探索其作用機制，具體如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物

MGC803和MKN45人胃癌細胞株（兩株細胞系均購于中國科學院上海生科院細胞資源中心）;健康SD雄性大鼠10只，由寧夏醫科大學實驗動物中心提供[許可證號SCXK90（寧）2015-0001]。

1.2 藥物

化痰散結方由以下藥物組成：半夏15 g，天南星15 g，浙貝10 g，生牡蠣30 g，全蝎6 g，地龍6 g，守宮6 g，烏賊骨15 g，炙甘草6 g，木蝴蝶15 g，鳳凰衣15 g，刺猬皮10 g，山甲粉3 g，蜈蚣6 g，藤梨根15 g（制成的水煎劑濃度為1.56 g/ml），由寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院提供。

1.3 試劑

四季清胎牛血清（浙江天杭生物科技公司）;CCK-8試劑 （日本同仁化學）;胰蛋白酶 （北京索萊寶生物有限公司），RPMI-1640培養基（HyClon公司）。

1.4 儀器

恒溫CO2培養箱HF-90 （Thermo Scientific） ;倒置顯微鏡CKX31 （OLYMPUS Corporation） ;連續波長及核酸蛋白微量檢測酶標議（Tecan瑞士）。

1.5 方法

1.5.1 含藥血清的制備 SD 大鼠10只，體重（180±20）g，適應性飼養7 d 后，隨機分為空白組和給藥組，每組5只。給藥組給予化痰散結方藥液，每日灌胃，2 ml/次。空白組給予等量生理鹽水，兩組均連續灌胃7 d。末次灌藥（灌藥前禁食不禁水12 h）2 h 后，10%水合氯醛麻醉，心尖采血，靜置2 h后，3 500 r/min離心10 min 后收集血清，同組血清混合置于離心管中，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-80 ℃分裝保存備用。

1.5.2 細胞培養及分組 MGC803和MNK45胃癌細胞分別接種于T25的培養皿中，在5% CO2 、37 ℃培養箱中培養，待細胞生長成對數生長期進行實驗。按照處理條件不同分組為空白血清組（10%空白血清）、5%組（5%含藥血清）、10%組（10%含藥血清）、15%組（15%含藥血清）和20%組（20%含藥血清）。

1.5.3 CCK-8法檢測胃癌細胞株增殖 用胰酶消化處于對數生長期細胞，用培養基分別稀釋成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl（MGC803，6×103個/孔;MKN45，5×103個/孔），培養24 h，待細胞貼壁。棄去原有培養液，加無血清培養液，饑餓12 h后，分別加入含藥血清或空白血清培養液100? μl，繼續分別培養24、48、72 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，再培養1 h。用酶聯免疫檢測儀在波長450 nm處讀取光密度（OD值）。每組每時段均設3個重復孔。抑制率計算方法：抑制率（%）=（給藥組平均OD值-空白組平均OD值）/給藥組平均OD值×100%。

1.6 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料以資料（x±s） 表示，采用單因素方差分析， 組間比較用LSD，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化痰散結方含藥血清對MGC803胃癌細胞株增殖的影響

10%組、15%組及20%組24 h內OD值均低于空白血清組，5%組、10%組、15%組及20%組48、72 h內OD值均低于空白血清組，隨著藥物濃度及時間的增加，抑制率也隨之升高，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 化痰散結方含藥血清對MKN45胃癌細胞株增殖的影響

5%組、10%組、15%組及20%組48、72 h內OD值均低于空白血清組，隨著藥物濃度及時間的增加，抑制率也隨之增加，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

CCK-8檢測法的特征是操作簡單，結果穩定，重復性佳，比MTT檢測法對實驗人員的毒副作用較安全[5]。

目前手術加化療是胃癌最常見的治療手段，但其化療副作用顯著，嚴重影響人們的生活質量。中醫藥能夠改善患者生活質量，減輕化療毒副反應，提高化療耐藥[6-7]，其作用機制值得深入探索。

化痰散結方含藥血清對MGC803和MNK45胃癌細胞均具有抑制作用，其中對MGC803胃癌細胞抑制作用較好，最佳干預濃度為20%，最佳干預時間為48 h。對MKN45胃癌細胞最佳干預時間為72 h，最佳干預濃度為20%。為本實驗后續的高通量測序提供基礎。中藥復方抗腫瘤的機制尚不明確，需要進一步對腫瘤移植到動物體內進行體內抗腫瘤實驗研究。

腫瘤乃有形實邪，治療多以“結者散之”“堅者削之”法[8]。臨床研究發現，化痰散結法聯合化療治療中晚期胃癌，改善患者生存質量，增效減毒[9-10]。實驗研究表明溫陽化痰散結方對患乳腺癌荷瘤鼠具有抑制腫瘤生長，改善生存期[11]。有學者運用化痰散結類中藥，抑制腫瘤生長轉移[12-14]，逆轉耐藥[15]。

胃癌當屬于中醫學“積聚”“癥瘕”等范疇。《瘍科心得集》云：“癌瘤者， 非陰陽正氣所結腫， 乃五臟瘀血濁氣痰滯而成。”導師郭維在臨床診治中體會到，腫瘤并非單一邪氣所為，也非單純的寒證和熱證，而是寒熱膠結[16]，再與痰瘀等邪氣相合，日久成積化毒致癌。故擬此方，本方由半夏、天南星燥濕化痰，浙貝、生牡蠣軟堅散結，此四藥共為君藥。全蝎、地龍、守宮、蜈蚣和山甲粉通絡散結共為臣藥。現代藥理學研究證明一些動物藥中所含的成分具有抑制或殺滅癌細胞、增強機體對腫瘤的免疫力、抑制轉移、止癌性疼痛等作用。木蝴蝶和胃，鳳凰衣養陰，刺猬皮散瘀止痛，烏賊骨制酸消炎止痛，藤梨根清熱解毒活血共為佐藥。炙甘草調和諸藥為使藥。該方辛開苦降，寒熱并用，具有化痰散結，和胃止痛，養陰解毒之功。

綜上所述，化痰散結方含藥血清對胃癌細胞株的增殖具有抑制作用，為后期開展實驗研究奠定基礎。

參考文獻

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（收稿日期：2019-11-06） （本文編輯：馬竹君）

基金項目：寧夏高等學校一流學科建設（中醫學學科）資助項目

（項目編號：NXYLXK2017A06）

寧夏回族自治區自然科學基金項目（項目編號：NZ17076）

①寧夏醫科大學中醫學院 寧夏 銀川 750004

②寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室

通信作者：郭維