MMP-9與TRAIL在結(jié)直腸癌的表達(dá)及對(duì)術(shù)后化療的評(píng)估意義

（惠東縣人民醫(yī)院 外一科，廣東 惠州 516300）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer,CRC） 包括結(jié)腸癌、直腸癌和肛門(mén)癌，是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，隨著近年來(lái)我國(guó)居民生活方式的改變及人口老年化的加劇，CRC的發(fā)病率及病死率均呈快速上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害居民健康[1,2]。雖然外科切除腫瘤組織、放化療及藥物靶向治療能夠有效延長(zhǎng)CRC患者生存時(shí)間，但CRC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因，因此深入分析CRC患者預(yù)后影響因素，尋找腫瘤組織敏感靶點(diǎn)是目前臨床研究關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）的重要成員之一，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 中的各種蛋白成分，破壞癌細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[4]；而腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）作為腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員之一，具有選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞卻無(wú)明顯毒作用[5]。目前有關(guān)MMP-9 和TRAIL在結(jié)直腸癌中表達(dá)的臨床意義尚不清晰，因此本研究利用免疫組化結(jié)合組織芯片技術(shù)，分析MMP-9和TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，初步探討兩者在結(jié)直腸癌中表達(dá)意義、相互關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象 以2010年12月-2014年6月期間在我院行結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實(shí)為原發(fā)性結(jié)直腸癌；②術(shù)后行化療治療；③術(shù)前未接受其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)隨訪記錄者；②初診時(shí)伴嚴(yán)重并發(fā)癥者；③病歷資料記錄嚴(yán)重缺失。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入本次研究的患者共60例，隨訪終點(diǎn)為死亡，隨訪的終點(diǎn)時(shí)間為2019年7月1日。所有研究對(duì)象均有一份詳細(xì)的生存和臨床調(diào)查表，記錄臨床資料及隨訪情況。統(tǒng)一在病理科收集切除的結(jié)直腸癌標(biāo)本及相鄰正常對(duì)比組織標(biāo)本，所有標(biāo)本分為兩部分，一份立即置于-80℃冰箱保存，一份制成組織芯片點(diǎn)陣。

二、研究方法 1.免疫組化SP法 標(biāo)本組織經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋，切片至厚4μm，常規(guī)脫蠟和水化后，加過(guò)氧化物酶阻斷內(nèi)源性酶的活性，分別滴加TRAIL和MMP-9Ⅰ抗體和生物素標(biāo)記的抗TRAIL和MMP-9Ⅱ抗體，孵育后貼片，晾干；脫水透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)各區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。利用HMIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像系統(tǒng)分析圖像灰度值。顯微鏡下觀察，照相。以PBS代替一抗，做陰性對(duì)照。

2.結(jié)果判斷與分組 采用光學(xué)顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，由兩個(gè)專(zhuān)業(yè)病理醫(yī)師進(jìn)行讀片，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)均采用FDA 推薦的Hercept-Test評(píng)分方法。通過(guò)繪制ROC 曲線計(jì)算研究對(duì)象MMP-9與TRAIL表達(dá)水平預(yù)測(cè)預(yù)后（隨訪5年死亡或存活）的最佳截點(diǎn)，并以此將研究對(duì)象分為MMP-9高表達(dá)組、MMP-9低表達(dá)組和TRAIL高表達(dá)組、低表達(dá)組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析利用SPSS22.0進(jìn)行，年齡等計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，差異性分析利用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料差異性分析利用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Kaplan-Meier法繪制研究對(duì)象生存曲線，2組患者的生存差異采用log-rank 檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、MMP-9和TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況 60份結(jié)直腸癌切除標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-9在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%，高于癌旁組織的48.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.084，P＜0.01）；TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.3%，低于癌旁組織的83.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.873，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 MMP-9，TRAIL在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況[n（%）]

二、MMP-9，TRAIL表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中MMP-9與TRAIL表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，見(jiàn)表2，可見(jiàn)MMP-9與TRAIL的高表達(dá)組與低表達(dá)組在患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置及浸潤(rùn)深度上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，低分化程度及臨床分期Ⅲ和Ⅳ標(biāo)本內(nèi)的MMP-9表達(dá)水平顯著升高，而TRAIL表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見(jiàn)結(jié)直腸癌的腫瘤組織中MMP-9與TRAIL表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性。

三、MMP-9，TRAIL的表達(dá)與化療預(yù)后的關(guān)系結(jié)直腸癌術(shù)后化療患者隨訪15～60月，中位數(shù)41月，包括非腫瘤相關(guān)死亡在內(nèi)，共失訪7例。MMP-9 高表達(dá)組與低表達(dá)組、TRAIL高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后化療生存分析如圖1所示，可見(jiàn)高M(jìn)MP-9 組與低MMP-9組，見(jiàn)圖1A、高TRAIL組與低TRAIL 組見(jiàn)圖1B，患者5年生存率分別為34.5%與61.2%、51.9%與26.8%。高M(jìn)MP-9組5年生存率低于低MMP-9組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高TRAIL 組5年生存率高于低TRAIL組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

表2 結(jié)直腸癌組織MMP-9與TRAIL 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

圖1 術(shù)后化療患者生存曲線（A 高M(jìn)MP-9 組與低MMP-9 組生存曲線比較；B 高TRAIL 組與低TRAIL 組生存曲線比較）

CRC是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，雖然外科切除結(jié)合放化療能夠有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率依然較高，如何控制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移無(wú)疑已成為結(jié)直腸癌，乃至整個(gè)腫瘤科學(xué)研究的焦點(diǎn)與難點(diǎn)[6]。MMP-9 能夠降解ECM中的各種蛋白成分，破壞正常組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，有關(guān)研究[7]發(fā)現(xiàn)MMP-9在乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)水平較高，與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；TRAIL是TNF超家族成員之一，具有選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，而對(duì)正常組織細(xì)胞卻無(wú)明顯毒作用，是當(dāng)前腫瘤細(xì)胞靶向殺傷治療研究的重要對(duì)象，但目前有關(guān)MMP-9和TRAIL在結(jié)直腸癌中表達(dá)的研究報(bào)道仍然較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，而TRAIL在腫瘤組織中表達(dá)低于癌旁組織，MMP-9和TRAIL在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。對(duì)MMP-9，TRAIL表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，MMP-9高表達(dá)和TRAIL低表達(dá)組結(jié)直腸癌細(xì)胞的分化程度較低，Ⅲ/Ⅳ患者比重較高，與對(duì)應(yīng)的低表達(dá)組/高表達(dá)組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且MMP-9低表達(dá)組術(shù)后化療5年生存率顯著高于高表達(dá)組（P＜0.05），而TRAIL低表達(dá)組卻低于高表達(dá)組，MMP-9 和TRAIL對(duì)CRC術(shù)后化療具有較好的評(píng)估效果。綜上所述，結(jié)直腸癌組織中MMP-9與TRAIL可能存在拮抗作用，共同影響腫瘤組織的分化進(jìn)展及預(yù)后，并有望成為CRC新的治療靶點(diǎn)，但尚需更為深入的研究。