分子標記輔助選育抗褐飛虱水稻恢復系

馮 銳，郭 輝，陳 燦，劉百龍，張曉麗，秦學毅

(廣西農業科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳改良重點開放實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】稻褐飛虱[(NilaparvatalugensSt?l)，簡稱BPH]是我國及亞洲地區水稻生產中為害最嚴重的害蟲。褐飛虱具有生長周期短、繁殖力強、易遷飛等生活習性，主要通過刺吸危害，造成水稻減產或絕收[1]，在我國發生面積達2500萬hm2/年，造成巨大經濟損失，也成為2003年以來稻米價格上升的主要原因之一[2]。目前，在我國大面積推廣的主栽水稻品種中對稻飛虱具有抗性的品種不多，稻田生態系統基本失去了抵御稻飛虱入侵的第一道天然屏障，抗性品種的嚴重缺乏已成為稻飛虱連續暴發的重要原因之一。分子標記輔助選擇(MAS)技術在水稻育種應用中已逐步得到發展和完善，并成為一種重要的育種技術[3-4]。通過分子標記輔助選擇有利基因對現有的資源或品種進行遺傳改良，已成為抗褐飛虱品種選育的重要途徑[5]。抗性育種以抗性基因的鑒定為前提，但是，抗蟲鑒定受蟲源、環境等影響較大，且耗時費力。利用分子標記輔助選擇技術可在早期世代選擇抗蟲株系，不受蟲源和環境影響，可提高育種效率[6-10]。因此，通過分子標記輔助選擇結合傳統育種技術進行抗褐飛虱水稻恢復系選育，對雜交稻抗性育種的種質資源選擇具有重要意義。【前人研究進展】近年來，培育和種植抗蟲水稻品種已成為安全、有效實現水稻產業綠色生產和可持續發展、降低農藥使用量的途徑之一[11]，通過分子標記輔助選擇，利用有利基因對現有的資源或品種進行遺傳改良已經成為行之有效的方法[12]。分子標記選擇技術可有效提高目標性狀的選擇效率，縮短育種周期[13]。在20世紀60年代，Pathak等[14]首次鑒定出栽培稻Mudgo為抗褐飛虱品種。李月鯤等[15]從304份水稻品種(組合)中篩選出抗褐飛虱性能穩定的R373(組合)作為培育抗褐飛虱水稻品種的基礎材料使用。張建福等[16]將分子標記輔助選擇技術與傳統育種結合，創制了米質優、配合力好且抗白背飛虱的新恢復系材料。閆成業等[17]利用分子標記輔助選擇改良了水稻恢復系R1005的褐飛虱抗性。羅世友等[18]利用分子標記輔助選育得到抗褐飛虱的改良恢復系。徐鵬等[19]通過分子標記輔助選育，使恢復系R813的稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性明顯提高。降好宇等[20]利用分子標記輔助選擇手段檢測攜帶廣譜抗稻瘟病基因Pi9的水稻品系75-1-127，發現其含有褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15，可作為抗源應用于水稻褐飛虱抗性育種。李進波等[21]在2006年已利用分子標記輔助選擇獲得160份目標基因純合且農藝性狀穩定的株系。【本研究切入點】目前，市場上推廣的水稻品種中抗褐飛虱品種為數不多，而少有的抗褐飛虱品種中對褐飛虱抗性較差，水稻生產中仍然依賴于化學藥劑來防治褐飛虱，但關于以分子標記輔助選擇含抗褐飛虱基因水稻品種的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以高抗褐飛虱水稻品系HS204為母本、恢復系明恢63為父本，通過雜交改良、回交和自交選育，結合分子標記輔助選擇和抗蟲鑒定，在改良后代中選擇褐飛虱抗性強的恢復系材料，為抗褐飛虱雜交稻育種提供良好的種質資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以HS204為供體親本(母本)，其高抗褐飛虱的抗性來源于廣西普通野生稻；以水稻恢復系明恢63為受體親本(父本，輪回親本)；以Ptb33為抗蟲對照(CK-R)；以TN1為感蟲對照(CK-S)。

1.2 試驗方法

1.2.1 選育流程 以HS204為母本、恢復系明恢63為輪回親本進行雜交，經2次回交后多次自交，從BC1F1世代開始進行分子標記輔助選育，在分離群體中篩選含抗褐飛虱基因的植株繼續與輪回親本回交，后代不斷自交，選育出抗性基因純合、農藝性狀表現優異的株系，最后進行苗期褐飛虱抗性鑒定。

1.2.2 分子標記 利用所篩選的與抗源HS204抗褐飛虱基因緊密連鎖的多態性SSR標記M4-10(F：5′-GTGTAGCTGCTAGGCCGAAC-3′，R：5′-TTCCTTT CGCTACGTTGGAC-3′)和INDEL標記M4-228(F：5′-TGTGCAGCTTTTTCAGGTTG-3′，R：5′-ATGTCGTTCCTTTTGCTGCT-3′)，對分離群體中的抗性基因進行跟蹤檢測，選擇攜帶目標基因的株系。

1.2.3 PCR反應體系和反應程序 參照CTAB法從水稻幼嫩葉片中提取DNA樣品。PCR反應體系10.0 μl：DNA模板1.0 μl，10×PCR Buffer(含Mg2+) 1.0 μl，10 mM dNTP 0.2 μl，5 U/μlTaqDNA Polymerase 0.1 μl，10 μM上、下游引物各0.2 μl，ddH2O補足10.0 μl。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃停止反應。參考李進波等[10]的方法進行電泳和銀染檢測。

1.2.4 褐飛虱苗期抗性鑒定 供試蟲源為廣西南寧田間采集混合生物型，在網室用TN1飼養繁殖備用，以褐飛虱生物型II為主，與部分越南九龍江型、孟加拉型和生物型I構成混合生物型。參照苗期集團篩選法將試驗材料分為若干組，取各組每份適量種子，催芽后條播于52 cm×33.5 cm×7.5 cm的鋁托盤內，每行播20～25 粒，當苗長至3 葉1心時去除小苗、弱苗，保留健壯一致的苗并統計苗數，按每株5～8頭接入2～3齡若蟲，置于紗網網室中，自然光照，室溫25～30 ℃，保持托盤一直有水。在感蟲對照品種TN1死亡7 d后調查對照受害癥狀等級表現，按照表1統計各株系的抗性水平。

1.2.5 改良株系及雜交配組組合主要農藝性狀測定 2018年夏季在廣西農業科學院水稻研究所試驗田種植改良株系與自育不育系1A、2A和10A進行配制的雜交組合，以天優華占為改良株系和雜交組合的對照(CK)。每個組合設3個重復，每小區種植40苗，每行種8株，單株插，密度為16.7 cm×20.0 cm，常規田間管理。記錄生育期，在成熟期每小區選取3株，考察株高、單株有效穗、穗長、每穗總粒數、結實率和千粒重等主要農藝性狀。

表1 褐飛虱抗性分級標準Table 1 Grade standard of resistance to brown planthopper in Oryza rufipog

圖1 MAS改良抗性水稻恢復系的育種路線Fig.1 The technical approach of improving rice resistant restorer line by MAS

1.3 統計分析

試驗數據采用Excel 2010進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 改良株系的構建及分子標記輔助選擇

從圖1可看出，雜合單株同時含有母本(供體親本HS204)、父本(受體親本明恢63)雙親的2個雙條帶，陽性純合單株只有與HS204相同的2個條帶，隱性純合單株只有與明恢63相同的2個單條帶。利用分子標記對單株進行檢測，共檢測到16個抗性基因純合單株，從中篩選獲得RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH-262共4個田間選擇農藝性狀與受體親本相似的恢復系單株。

M：200 kb Marker；P1：供體親本HS204；P2：受體親本明恢63；F1：雜交一代；泳道1～30：BC2F2代分離群體單株M：200 kb Marker；P1：Donor parent HS204；P2：Recipient parent Minghui 63；F1：First-filial generation；Lane 1-30：Segregation population of BC2F2圖2 分子標記檢測BC2F2代單株的部分檢測結果Fig.2 Detection of molecular marker in partial individuals of BC2F2 population

表2 育成株系對褐飛虱的抗性鑒定結果Table 2 Identification of resistance of restorers against BPH

2.2 改良株系對水稻褐飛虱的抗性鑒定

抗性評價工作在南寧市廣西農業科學院溫室進行，以感蟲品種TN1、抗蟲品種PTB33為對照，對選擇的4個株系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH-262進行褐飛虱抗性鑒定。從抗性鑒定結果(表2)可看出，感蟲品種TN1全部枯死(9級)，4個中選株系RMH-3(3.9級)、RMH-58(1.9級)、RMH-153(3.1級)和RMH-262(1.8級)表現抗和高抗褐飛虱。說明改良株系的抗性較受體親本明恢63明顯提高。

2.3 改良株系及雜交配組的主要農藝性狀表現

將選育的4個恢復系改良株系與自育的不育系1A、2A和10A進行配組，獲得12個測交組合，對其8個主要農藝性狀的分析結果(表3)表明，各測交組合的株高在102.5～120.5 cm，其中1A×RMH-3的株高最矮，明顯矮于父本RMH-3，而2A×RMH-262的株高最高，明顯高于父本RMH-262；改良株系RMH-3與3個不育系配組的3個組合的有效穗數(分別為7.5、8.5和8.0穗/株)均比父本RMH-3有所增加，改良株系RMH-58與不育系1A、2A配組組合的有效穗數(分別為8.0和7.5穗/株)較父本RMH-58明顯增加，而與不育系10A配組組合的有效穗數明顯減少；4個改良株系中，除RMH-58外其余3個改良株系的穗長(26.5～27.8 cm)均不同程度長于其父本明恢63，而12個雜交組合中，除2A×RMH-153外其他11個雜交組合的穗長(27.5～32.0 cm)均長于受體親本明恢63；4個改良株系的每穗實粒數(172.8～233.0粒)均明顯少于其父本明恢63，而12個雜交組合的每穗實粒數或多于或少于受體親本明恢63；4個改良株系的結實率與12個雜交組合無明顯差異，而4個改良株系和12個雜交組合的千粒重和單穗重均明顯高于受體親本明恢63；4個改良株系谷粒的長寬比除RMH-58稍小于父母本外其余均介于父母本之間，而大部分雜交組合谷粒的長寬比小于供體親本HS204，部分大于受體親本明恢63，部分小于受體親本明恢63。說明改良株系及其配制的多數雜交組合具有良好的產量表現，部分農藝性狀甚至優于受體親本明恢63。

表3 改良株系與雜交配組組合的產量和主要農藝性狀表現Table 3 The yield and main agronomic traits of the improved lines and their hybrids

表4 改良株系所配組合對褐飛虱的抗性評價結果Table 4 Resistance of the improved lines and their combinations against BPH

2.4 改良株系配制雜交組合的抗性評價

2018年秋季，對改良株系所配制的12個雜交組合及感蟲品種TN1和抗蟲品種PTB33進行抗性評價，結果(表4)表明，12個組合中有4個組合表現高抗，平均抗級1.8～1.9；有5個組合表現抗，平均抗級2.7～3.9；有2個組合表現中抗，平均抗級4.0～4.6，有1個組合表現感，平均抗級7.0。說明改良株系組配雜交組合的整體抗性表現良好。

3 討 論

目前，分子標記輔助選擇在低世代僅對目標基因進行選擇，無需進行抗性鑒定，具有選育效率高、準確性好、經濟和不受環境影響等優點，已廣泛應用于水稻抗性育種。如夏明元等[22]選育出含Bph14基因的恢復系R476；李進波等[23]通過回交轉育結合分子標記輔助選育，將GD-7的抗稻瘟病基因轉育到受體揚稻6號中，獲得了10個雙基因純合且農藝性狀優良的水稻新品系；蘭艷榮等[24]利用分子標記輔助選擇改良水稻光溫敏核不育系華201S的白葉枯病抗性，獲得4個表現良好的抗性株系；陽海寧等[25]采用回交與分子標記輔助選擇相結合的方法，獲得抗稻白葉枯病基因Xa23和抗稻褐飛虱基因Bph3雙抗性基因聚合系144份；閆成業等[25]采用分子標記輔助選擇技術與傳統育種的雜交、回交相結合，將抗稻瘟病基因Pi9導入R1005中，育成的恢復系含有抗性基因，抗性較父本明顯增強。本研究結果與上述研究報道相似，通過分子標記輔助選擇獲得了褐飛虱抗性較父本明恢63明顯增強的恢復系株系。

野生稻是水稻育種的寶貴種質資源。胡杰等[27]研究表明，在水稻中已有30多個抗褐飛虱主效基因被報道，其中有20個基因來源于野生稻，本研究中含有顯性基因抗源的供體親本(母本)HS204也是利用廣西普通野生稻培育獲得的高抗品系。本研究通過分子標記輔助選育方法將廣西本土野生稻的優良抗性基因與恢復系明恢63進行雜交，結合苗期鑒定，在后代中選育出對褐飛虱抗性表現較好的4個改良株系，其農藝性狀和產量性狀表現優良，配合力強，可作為配制抗褐飛虱雜交組合的遺傳資源利用。

在實際生產中，褐飛虱的大暴發多發生在水稻成株期，但部分水稻品種苗期和成株期對褐飛虱的抗性不一致，有些品種是苗期抗蟲、成株期感蟲，而有些品種是苗期感蟲、成株期抗蟲[28]，本研究還需在目前工作的基礎上將獲得的抗褐飛虱改良恢復系進行成株期抗性鑒定，并進行持續和廣泛的測配，以進一步明確所獲得改良恢復系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH262的褐飛虱抗性表現。

4 結 論

以分子標記輔助選育方法將廣西本土野生稻的優良抗褐飛虱基因與恢復系明恢63進行雜交，結合苗期鑒定，在后代中選育出4個改良恢復系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH262，其褐飛虱抗性表現佳，農藝性狀和產量性狀表現良好，配合力強，可作為配制抗褐飛虱雜交組合的遺傳資源利用。