凋亡調(diào)節(jié)蛋白XIAP與Omi/HtrA2在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及其與患者預(yù)后的關(guān)系

卞 樂，艾麗梅

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液二科, 遼寧 錦州 121000)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一類，呈高發(fā)病和高度侵襲性，約占成人NHL的30%，且我國DLBCL的發(fā)病人數(shù)也在逐年增多[1]，經(jīng)積極的治療少部分患者可有較好預(yù)后[2-3]。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一類抑制細胞凋亡的家族，國內(nèi)外研究表明生物體細胞的凋亡失去控制是導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生的機制之一[4]。IAPs家族中作用較強的成員X染色體連鎖凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of ap-optosis protein，XIAP)，主要通過抑制半胱酸天冬氨酸蛋白酶分子(caspase)的活性來抑制細胞凋亡[5]。線粒體產(chǎn)生的一種特殊的絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可阻止XIAP和caspase的這種結(jié)合而促進細胞的凋亡[6-8]，XIAP和Omi/HtrA2在細胞中的特異性表達與機體惡性病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，但國內(nèi)外對這兩種蛋白在DLBCL中的表達研究甚少。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測XIAP與Omi/HtrA2在DLBCL中的表達情況，并分析二者的相關(guān)性，通過隨訪分析兩種蛋白與DLBCL患者的預(yù)后，為DLBCL的靶向治療和預(yù)后評估提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2017年1月至2018年12月間于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院治療的59例DLBCL患者病理切片為實驗組。參照2013版《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷和治療指南》及2011版《彌漫大B細胞淋巴瘤臨床路徑》，以活檢病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析明確診斷，其中發(fā)病年齡25～79歲，中位年齡為62歲，男性32例，女性27例，病理類型：生發(fā)中心(GCB)型28例，非生發(fā)中心(nGCB)型31例，Ann Arbor-Cotswolds分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期19例，Ⅳ期15例。同時選取同期在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院治療的30例淋巴結(jié)反應(yīng)增生(RCL)患者病理切片作為對照組。

1.2 相關(guān)試劑 XIAP兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶200)、Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 研究方法 采用免疫組織化學(xué)法將石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟和水化后，將切片于蒸餾水中浸泡1 min，用PBS沖洗5 min，共沖洗3次，在高壓鍋中用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫后用50 μl的過氧化物酶阻斷，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，滴加封閉用正常山羊血清50 μl，室溫孵育20 min，甩去多余的液體，擦干切片，勿洗，滴加一抗，4 ℃濕盒過夜，次日取出切片，PBS緩沖液沖洗5 min，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物50 μl，室溫孵育15 min，PBS沖洗5 min，用50 μl辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育20 min，在光學(xué)顯微鏡下用新鮮配制的DAB溶液顯色5 s，蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化后復(fù)染，最后經(jīng)逆濃度乙醇脫水，二甲苯透明化后用中性樹脂固封。

1.4 結(jié)果判定 在光學(xué)顯微鏡下應(yīng)用半定量積分的方法，即根據(jù)每張病理切片染色的深淺程度和蛋白陽性表達的細胞比例來計算積分。切片染色程度：無著色即0分，淺黃色即1分，棕黃色記2分，深棕色記3分。蛋白陽性表達的細胞比例：無陽性表達記0分，陽性表達小于25%記1分，陽性表達在25%～50%記2分，陽性表達大于50%記3分。最后的得分是將每張病理切片染色程度得分和蛋白陽性表達的細胞比例得分兩兩相乘。結(jié)果判定如下：陰性(-)： 0～1 分；弱陽性(+)：2～3 分；中等陽性(++)：4～6 分；強陽性(+++)：6分以上。觀察結(jié)果由至少2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師判定，若得出的結(jié)果沖突，可進行3次觀察與計算，得出最終結(jié)論。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料組間比較應(yīng)用χ2檢驗；應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析XIAP和Omi/HtrA2蛋白表達的相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-meier法分析XIAP和Omi/HtrA2的表達與DLBCL患者的預(yù)后；應(yīng)用COX比例風(fēng)險模型計算各臨床因素的風(fēng)險比(hazard radio，HR)和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)來評估對疾病預(yù)后不良的影響程度，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XIAP在DLBCL和RHL組織中的表達 XIAP在DLBCL組織中主要在細胞質(zhì)中表達 ，為棕黃色顆粒狀，形態(tài)、大小不等(圖1)，陽性率為61.02%(36/59)，在RHL組織中的陽性表達為36.67%(11/30)(圖2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030)，見表1。

表1 DLBCL和RHL組織中XIAP表達

注：χ2=4.732，P=0.030

2.2 Omi/HtrA2在DLBCL和RHL組織中的表達 Omi/HtrA2在DLBCL組織中主要表達在細胞質(zhì)，為形態(tài)大小不均的棕黃色顆粒狀(圖3)，陽性率為52.54%(31/59)，在RHL組織中可見少量棕黃色顆粒(圖4)，陽性率為30.00%(9/30)，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.043)，見表2。

圖1 XIAP在DLBCL組中的表達(SP×400) 圖2 XIAP在RHL組中的表達(SP×400)

圖3 Omi/HtrA2在DLBCL組中的表達(SP×400) 圖4 Omi/HtrA2在RHL組中的表達(SP×400)

表2 DLBCL和RHL組織中Omi/HtrA2表達

注：χ2=4.084，P=0.043

2.3 XIAP和Omi/HtrA2表達的相關(guān)性分析 采用Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，二者的表達呈負相關(guān)(P=0.018)，見表3。

表3 XIAP與Omi/HtrA2表達的相關(guān)性(例)

2.4 XIAP蛋白與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 XIAP的陽性表達與DLBCL患者的臨床分期(P=0.012)、病理類型(P=0.012)、乳酸脫氨酶(LDH)水平(P=0.026)、淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分(P=0.043)相關(guān)，與患者的性別、年齡、有無結(jié)外受累、癥狀分組無關(guān)(P>0.05)，見表4。

2.5 Omi/HtrA2蛋白與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 Omi/HtrA2的陽性表達與DLBCL患者的臨床分期(P=0.033)、病理類型(P=0.013)、LDH水平(P=0.010)、IPI評分(P=0.019)相關(guān)，與性別、年齡、癥狀分組、有無結(jié)外受累無關(guān)(P>0.05)，見表5。

2.6 生存分析 本研究對59例DLBCL患者進行了電話隨訪，截止到2019年12月31日，隨訪時間為40個月，期間有2例患者失訪，失訪率為3.38%，其中死亡27例，復(fù)發(fā)31例，1年總生存率(OS)84.75%，2年OS 64.41%，3年OS 55.56%；1年無進展生存率(PFS)83.05%，2年P(guān)FS 59.32%，3年P(guān)FS 47.00%。

2.6.1 XIAP蛋白的表達與DLBCL預(yù)后的關(guān)系 生存分析顯示，XIAP陽性表達的患者3年OS和3年P(guān)FS與陰性表達的患者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007，P=0.008)，見圖5～6。

2.6.2 Omi/HtrA2蛋白的表達與DLBCL預(yù)后的關(guān)系 生存曲線顯示，Omi/HtrA2陽性表達的患者3年OS和3年P(guān)FS與陰性表達的患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.122，P=0.385)，見圖7～8。

2.6.3 XIAP和Omi/HtrA2共同表達與DLBCL的預(yù)后 由生存曲線可看出，XIAP和Omi/HtrA2雙陽性表達與雙陰性表達的患者3年OS和3年P(guān)FS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.466，P=0.261)，但從曲線中可以看出XIAP單陽性表達的患者無論Omi/HtrA2是否為陽性，患者的3年OS和3年P(guān)FS差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖9～10。

表5 Omi/HtrA2與DLBCL臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[例(%)]

圖5 XIAP蛋白的OS曲線 圖6 XIAP蛋白的PFS曲線

圖7 Omi/HtrA2蛋白的OS曲線 圖8 Omi/HtrA2蛋白的PFS曲線

圖9 XIAP和Omi/HtrA2共同表達的OS曲線 圖10 XIAP和Omi/HtrA2共同表達的PFS曲線

2.6.4 臨床指標(biāo)單因素及多因素預(yù)后分析 采用Kaplan-meier法對各個臨床指標(biāo)進行分析，包括患者性別、年齡、淋巴瘤分期、LDH水平、癥狀分組、 病理類型和有無結(jié)外受累等。結(jié)果顯示：患者的性別、年齡、癥狀分組、結(jié)外受累與患者預(yù)后無關(guān)(P>0.05)。患者淋巴瘤分期為Ⅲ～Ⅳ(P=0.022)、LDH>250 U/L(P=0.015)、病理類型為nGCB(P=0.034)、IPI為中高危(P=0.001)是DLBCL患者3年OS的預(yù)后不良因素，患者淋巴瘤分期為Ⅲ～Ⅳ(P=0.017)、LDH>250 U/L(P=0.041)、病理類型為nGCB(P=0.026)、IPI為中高危(P=0.018)是DLBCL患者3年P(guān)FS的預(yù)后不良因素。

采用COX回歸多風(fēng)險比例模型分析得出XIAP的陽性表達是影響DLBCL患者3年OS(HR=7.527，95%CI為1.527～37.049，P=0.013)和3年P(guān)FS(HR=0.291，95%CI為0.125～0.677，P=0.004)的獨立預(yù)后不良因素，見表6～7。

表6 單因素分析DLBCL的3年OS和3年P(guān)FS

表7 DLBCL的3年OS和3年P(guān)FS多因素分析

3 討 論

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)，是多生物體細胞經(jīng)特定基因的調(diào)控自動發(fā)生死亡的過程，可有效維持人體自身平穩(wěn)，細胞凋亡失去控制是機體產(chǎn)生腫瘤的機制之一[9-10]。

XIAP定位于染色體Xq25位點，具有兩個特征性的分子結(jié)構(gòu)域，一是位于XIAP氨基端的3個桿狀凋亡蛋白抑制重復(fù)序列(BIR)，IAPs家族主要依賴BIR結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，二是位于XIAP羧基端的1個鋅指結(jié)構(gòu)環(huán)(RING)，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)有泛素蛋白連接酶的作用。XIAP抗細胞凋亡的作用主要與抑制caspase[5, 11]、激活核因子κB(NF-κB)途徑和參與多條信號通路有關(guān)[12]。國內(nèi)外大量研究顯示XIAP在胃癌[13]、乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、肺癌[16]等惡性病的組織均呈現(xiàn)特異性表達。

Omi/HtrA2是一種主要分布在線粒體的促凋亡蛋白，在凋亡信號的作用下Omi/HtrA2可轉(zhuǎn)化為具有促細胞凋亡的成熟因子，由線粒體釋放至胞內(nèi)，通過依賴caspase和非依賴caspase兩條通路促進細胞凋亡[17]。在依賴caspase途徑中，成熟的Omi/HtrA2氨基端可直接與IAPs氨基端的BIR特異性結(jié)合，降解IAPs，恢復(fù)caspase的活性從而解除對細胞凋亡的抑制，也可通過利用自身蛋白酶的活化促進凋亡。有研究顯示，Omi/HtrA2在白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤疾病中以多種的途徑促進細胞的凋亡[18-20]。

本實驗顯示，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中呈高表達，在RHL中為低表達甚至不表達，二者的陽性表達與DLBCL的臨床分期、病理類型、LDH水平、IPI評分有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、癥狀分組、結(jié)外受累無關(guān)(P>0.05)。XIAP和Omi/HtrA2表達為負相關(guān)，說明XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中作用相互抑制。

此外Kaplan-meier曲線顯示XIAP與DLBCL患者預(yù)后相關(guān)，而Omi/HtrA2與患者預(yù)后無關(guān)，不能作為判斷預(yù)后的指標(biāo)，但通過生存曲線得出Omi/HtrA2陽性率高的患者比陽性率低的患者預(yù)后好，可能是高表達的Omi/HtrA2促進了惡性細胞的凋亡，減少了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)從而使患者的生存期延長。

綜上所述，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中同為高表達，表達為負相關(guān)性，二者作用相互拮抗，檢測XIAP和Omi/HtrA2有助于DLBCL的臨床診斷和靶向治療，XIAP與DLBCL的預(yù)后相關(guān)，有望成為評估預(yù)后的新指標(biāo)。