基于網絡藥理學的酒燉白芷藥效作用機制研究

謝鑫榮 朱春璐 袁子民 喬宇航 劉婉瀅 張嘉玉 張馨如 吳思語

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

白芷藥用歷史悠久，具有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅等功效，其古代記載有酒浸、酒蒸、酒炒、醋制、鹽水炒等多種炮制方法，但現代很少應用。酒燉白芷主要用于2015版《中國藥典》一部收載的成方制劑“都梁丸”中，制備方法為取白芷飲片，加入黃酒(每100 kg白芷加入黃酒20 kg)，經悶潤、隔水蒸制后干燥制得。酒燉白芷由于黃酒成分的引入及受熱炮制作用可使其化學成分及藥效作用與白芷存在差異，前期化學成分研究中發現酒燉白芷中含有與白芷基本相同的化學成分，只是含量有所差異[1-2]，但引入的黃酒的成分，由于技術限制尚需進一步研究。目前，白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等[3]藥理作用方面報道較多，但白芷經黃酒炮制制成酒燉白芷后，是否對其藥效產生影響或具有增強藥效作用及都梁丸中為何采用酒燉白芷而不采用白芷入藥，還需結合藥效作用機制進一步深入研究。因此，為增加酒燉白芷炮制品在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇等疾病方面的應用，筆者擬以黃酒與白芷中所含的主要化學成分作為酒燉白芷中可能含有的活性成分為篩選對象，采用網絡藥理學的方法，著重探討酒燉白芷在抗偏頭痛、治療鼻炎、抗癲癇的藥效作用機制，并綜合分析活性成分靶點、相關生物信號通路與疾病的關聯性，為酒燉白芷炮制機理、藥效作用機制的深入研究及其在臨床應用提供科學依據。

1 材料

ChembioDraw Ultra軟件(Version 13.0)、Cytoscape軟件(Version 3.6.1)、R軟件、UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca)、NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、String數據庫(https://string-db.org)、TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、PharmMapper Serve數據庫(http://59.78.96.61/pharmmapper)。

2 方法

2.1 酒燉白芷活性成分的篩選 酒燉白芷為白芷經輔料黃酒炮制制得，其所含主要的化學成分可能主要源于白芷與黃酒中的成分。通過TCMSP數據庫獲取白芷的化學成分，以類藥性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%為篩選條件，選取DL≥0.18和OB≥30%的化學成分作為白芷的潛在藥效成分。由于酒燉白芷經輔料黃酒炮制，經對黃酒的活性成分進行文獻的挖掘與整理，同時列為酒燉白芷的活性成分。

2.2 作用靶點的獲取 采用ChembioDraw Ultra軟件繪制活性成分三維結構圖，以SYBYL2(*.mol2)格式保存，并通過PubChem和TCMSP數據庫進行結構驗證，將活性成分的SYBYL2(*.mol2)格式文件上傳到PharmMapper Serve數據庫中獲取靶點信息，再將該數據庫中Uniplot一欄上傳到UniProt數據庫中并將限定選為人，將靶點名稱校正為官方名稱。

2.3 疾病相關靶點的篩選 在GeneCards、DrugBank和NCBI數據庫中輸入migraine(cephalagra、hemicrania、antimigraine)、rhinitis(nasitis)和epilepsia(epilepsy、hieronosus)搜索文獻已報道的與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關的基因，去除重復的和假陽性基因，與上述PharmMapper Serve數據庫獲得的靶點進行對比分析，得到活性成分中的抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇的潛在作用靶點。

2.4 通路富集與分析 將通用蛋白編號(Uniprot ID)導入R軟件中，對所有蛋白的編碼基因進行GO注釋分析和KEGG通路分析，計算各通路P值并預測相關靶點蛋白參與表達的生物學通路(P<0.05)，采用Cytoscape軟件構建酒燉白芷的靶點通路網絡圖。

2.5 網絡構建 將酒燉白芷的活性成分、作用靶點、相關疾病、通路導入Cytoscape軟件中，構建活性成分-作用靶點、疾病-作用靶點-通路網絡，以探究酒燉白芷在抗偏頭痛、鼻炎以及癲癇方面的藥效作用機制。

3 結果

3.1 酒燉白芷活性成分的篩選 從TCMSP數據庫中獲得223個白芷化學成分，以DL≥0.18和OB≥30%為篩選條件，結合文獻報道，共獲取17個活性成分。依據文獻報道，結合黃酒中化學成分的性質，選取含量高、無揮發性、耐熱性的10個成分作為黃酒的主要活性成分，將篩選出的白芷中的17個成分與黃酒中的10個成分，即共27個成分為酒燉白芷主要活性成分，結果見表1。

3.2 靶點預測 將表1中27個活性成分在PharmMapper Serve數據庫中返回的潛在作用靶點按匹配度(Fit)降序排列，各取前25個靶點，除去重復項后得到144個基因靶點，通過GeneCards、DrugBank和NCBI數據庫與相關基因進行對比，篩選與抗偏頭痛、鼻炎和癲癇相關聯的可能潛在作用靶點，分別為60個、51個、17個，表2列舉Degree值排名前10的靶點蛋白。

表1 酒燉白芷的活性成分

表2 酒燉白芷活性成分潛在靶點

續表2

表2 酒燉白芷活性成分潛在靶點

3.3 活性成分-作用靶點網絡圖的構建和分析 構建的酒燉白芷活性成分-作用靶點網絡圖(圖1)，圖中共有171個節點，678條線，紅色菱形節點代表酒燉白芷的活性成分(外圍是白芷的活性成分，內環是黃酒的活性成分)，綠色圓形節點代表作用靶點，灰色細線代表活性成分與作用靶點間相互關聯。表明酒燉白芷的藥效作用具有多成分、多靶點的特點。

3.4 通路富集與分析 采用R軟件對酒燉白芷靶點蛋白進行KEGG通路富集，共富集134條，其中P值<0.05的有117條，部分通路信息(見圖2)。表明酒燉白芷主要通過環磷酸腺苷、環磷酸鳥苷-依賴性蛋白激酶、T細胞受體、Ras、MAPK、雌激素、PI3K/Akt、VEGF和Mtore等9條信號通路發揮抗偏頭痛、鼻炎、癲癇的藥效作用；GO注釋分析表明在生物過程中這些靶點主要涉及蛋白質磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾；在分子功能中主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、激酶調節活性、RAS鳥苷酸交換因子活性、鳥苷酸交換因子活性等方面；在細胞組成中主要涉及膜質側、膜筏、膜微區、膜區等方面，GO注釋分析信息見圖3。圖4為靶點-通路-疾病圖，其中紅點為疾病，藍點為通路，黃點為靶點。

4 討論

研究結果表明，酒燉白芷主要通過環磷酸腺苷(cAMP)、環磷酸鳥苷-依賴性蛋白激酶(cGMP-PKG)、MAPK信號通路發揮抗偏頭痛藥效作用。同時在調控MAPK信號通路發揮抗偏頭痛中，酒燉白芷共富集22個靶點，而生白芷為15個；酒燉白芷主要通過調控環腺苷-磷酸、T細胞受體和Ras信號通路發揮抗偏頭痛作用，與生白芷相比，酒燉白芷在各個通路富集靶點多，并比生白芷多了雌激素、cGMP-PKG兩條信號通路。有研究表明NO被認為是引起原發性偏頭痛的觸發物，可舒張平滑肌，擴張腦內血管，進而增加痛覺的傳導，導致中樞敏化[4]。腦血管神經末梢內含有NOS，在NOS催化下，L-精氨酸產生NO，通過與G蛋白偶聯的膜受體結合激活可溶性鳥苷酸環化酶，從而使細胞內鳥苷酸(cGMP)水平升高。NO并可誘導三叉神經節細胞合成和分泌CGRP，CGRP是目前最強血管擴張藥物，對腦、心血管最為明顯。CGRP通過平行的信號通路，增加腺苷酸環化酶和環磷酸腺苷(cAMP)的產生[5]。對抗CGRP和NO信號的化合物、CGRP拮抗劑和NO合成酶抑制劑均可減輕偏頭痛。另外，MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK家族主要包括細胞外調節蛋白激酶 (ERK) 、c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 和p38絲裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)，分別介導3條并行的MAPK信號通路[6]。TNF-α和IL-6等炎性因子可通過上調p-ERK1/2、p-p38及p-JNK的表達，激活MAPK通路，進而在細胞的增殖、凋亡、炎癥及免疫等多方面發揮關鍵的作用[7-9]。因此，推測酒燉白芷可能通過調控cAMP信號通路和cGMP-PKG信號通路，降低CGRP和NO的產生和分泌，并通過阻斷MAPK通路，減少炎癥因子的釋放，發揮抗偏頭痛的作用。

研究發現酒燉白芷抗鼻炎的作用可能與PI3K/Akt、VEGF通路有關，PI3K/Akt通路是VEGF誘導內皮細胞存活和遷移的重要信號分子，ERK通路也涉及細胞存活和遷移的調節[10]，P13K、Akt和ERK1/2的磷酸化水平與VEGR的產生具有一致的趨勢。血管內皮生長因子(VEGF)和MMP-9在促進鼻黏膜組織腫脹與腺體分泌亢進過程中發揮重要作用。VEGF可能是MMP-9高表達的誘導因素[11]，可促進血管增生及通透性，參與鼻腔黏膜腫脹及腺體分泌亢進過程。酒燉白芷可能通過抑制PI3K/Akt通路和ERK通路，可以顯著降低VEGF的產生，下調MMP-9的表達發揮抗鼻炎的作用。另外，酒燉白芷還可能通過調控P13K/AKt和ERK1/2信號通路發揮抗癲癇作用。在癲癇發生過程中，短期內即可促使信號通路被激活表達p-ERK1/2，通過調節ERK1/2信號通路，可對癲癇發作產生拮抗作用[12]；其中PI3K/AKt信號通路是調節神經細胞各項活動的重要通路之一，廣泛參與神經元細胞的生存、分化、凋亡等過程，當P13K/AKt通路被抑制時，可以有效抑制海馬神經元凋亡[13]。mTOR為P13K/AKt途徑的下游絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，mTOR抑制劑可以有效預防癲癇發作[14]。在調控P13K/AKt信號通路發揮抗鼻炎和癲癇作用中，酒燉白芷共富集29個靶點，而生白芷為22個，且比白芷多1個治療鼻炎的VEGF信號通路。酒燉白芷在mTOR信號通路共富集10個靶點，而生白芷為7個。

在靶點預測分析中發現，酒燉白芷中ESR1、IL-2和NOS3等與偏頭痛相關的靶點度值、EGFR和MAPK8等與鼻炎相關的靶點度值、GSTP1、GSTA1和GSTM1等與癲癇相關的靶點度值，均高于生白芷中相關靶點度值。

綜上所述，白芷酒燉后與偏頭痛、鼻炎和癲癇相關的靶點、通路均多于白芷，且靶點度值增大，可能主要與黃酒成分的引入及水合氧化前胡素含量增加[2,15,16]等因素有關，其藥效作用機制體現了中藥多成分-多靶點-多通路的特點，為酒燉白芷“酒制升提”或“引藥上行”的炮制機制的深入研究提供了新思路。但其對藥效作用的改變或藥效作用的增強還需進一步通過體內藥效實驗進行驗證。