響應曲面法優化防己中漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝

胡筱希 朱榮 唐 新 黃大權 盧文杰 陸國壽

1.廣西中醫藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西大海陽光藥業有限公司，廣西 南寧 530022

防己為防己科植物粉防己(Stephaniatetrandra S.Moore)的干燥根,具有祛風止痛、利水消腫、用于風濕痹痛、水腫腳氣、小便不利、濕疹瘡毒等[1]。防己中的漢防己甲素(又名粉防己堿)和漢防己乙素(又名防己諾林堿)為其主要的活性成分，兩者均為天然的雙芐基異喹啉類生物堿，漢防己甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗心律失常、抗菌、降壓等作用[2]，以其為主要成分的中成藥“漢防己甲素”和“漢防己甲素注射液”廣泛用于臨床上對各期矽肺病的治療[3-4]。漢防己乙素具有抗肝缺血再灌注損傷、誘導人肺癌95D細胞凋亡等作用[5-6]。本實驗擬采用單因素試驗結合響應曲面法優化防己中的漢防己甲素及漢防己乙素的提取工藝，為防己中的活性成分研究及深度開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 數顯恒溫水浴鍋HH-S2(金壇市醫療儀器廠)，JJ224BC電子天平(常熟雙杰)，Waters2695 高效液相色譜儀(日本 Waters 公司)，KS-3200DE超聲波清洗器(昆山潔力美)，LDZ4-0.8A離心機(北京醫用離心機廠)。

1.2 藥材與試劑 防己藥材由廣西大海陽光藥業有限公司提供；漢防己甲素HPLC≥98%(YM0311YBB，上海源葉生物)；漢防己乙素HPLC≥98%(RO1A6F2，上海源葉生物)；乙腈、甲醇、二乙胺為色譜純；乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 漢防己甲素和漢防己乙素測定方法

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-0.1%二乙胺(30∶35∶35)；檢測波長：282 nm；柱溫：25℃；理論塔板數：按漢防己甲素峰計算不低于5000；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。如圖1所示。

2.1.2 溶液配制 ①對照貯備液：分別精密稱取12.5 mg漢防己甲素、漢防己乙素，用甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得500 μg/mL的混合對照品溶液。②供試品溶液：精密稱取1.0 g防幾藥材，加適量超聲提取得溶液到供試品。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，如圖1所示。

2.1.3 標準曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液貯備液0.8、1.2、1.6、2、2.4、3. 2 mL，稀釋到10 mL，搖勻，得到40、60、80、100、120、160 μg/mL混合對照品溶液。以甲醇作為空白溶液，注入色譜儀，以峰面積為縱坐標，以對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得漢防己甲素回歸方程Y=9038.4X-100992，相關系數r2=0.9997；漢防己乙素回歸方程Y=7137X-38969，相關系數r2=0.9998。

2.2 單因素提取試驗

2.2.1 乙醇體積分數 稱取防幾藥材粉末1.0 g，在料液比1∶40 g/mL，超聲時間40 min，分別以60%、70%、80%、95%、100%乙醇提取，結果如圖2所示。漢防己甲素、漢防己乙素均在70%提取率最高。

2.2.2 料液比 稱取防己藥材粉末1.0 g，在乙醇濃度95%，超聲時間40 min的條件下，分別以料液比(g∶mL)1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60進行提取，結果如圖3所示。漢防己甲素在料液比1∶40時，提取率最高，漢防己乙素在1∶50時提取率最高。

2.2.3 超聲時間的影響 稱取防己藥材粉末1.0 g，在乙醇濃度95%，在料液比1∶40 g/mL，分別提取20、30、40、50、60 min，結果如圖4所示。在20～50 min漢防己甲素及漢防己乙素的提取率均呈上升趨勢，超過50 min提取率下降，因此超聲時間在50 min較合適。

2.3 響應曲面實驗設計 根據單因素試驗結果和響應面中心組合試驗設計原理，選取3個因素為響應因素，浸膏中漢防己甲素、漢防己乙素提取率為響應值，運用Design-Expert 10軟件設計三因素三水平響應面試驗，結果見表1。

2.4 響應面優化試驗結果 試驗方案及結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

表2 響應面優化實驗分析方案及結果

擬合試驗數據，建立二次多元回歸方程：R(漢防己甲素)=13.08-0.42B+0.15B+0.24C+0.20AB-7.500E-0.03AC-0.060BC-0.066A2-0.12B2-0.19C2；R(漢防己乙素)=8.33-0.51A-0.27B+0.073C+0.19AB-0.22AC-0.15BC-0.52 A2-0.33 B2-0.044C2，對其進行方差分析，結果見表3、表4。

表3 方差分析表(漢防己甲素)

表4 方差分析表(漢防己乙素)

2.5 驗證試驗 在最佳提取漢防己甲素工藝乙醇體積分數為60%，料液比為1∶36.07，超聲時間為57.12 min，進行3次試驗，提取率分別為13.48 mg/g、13.51 mg/g、13.54 mg/g，平均值為13.51 mg/g。在最佳提取漢防己乙素工藝乙醇體積分數為62.49%，料液比為1∶37.71，超聲時間為59.38 min，提取率分別為為8.75 mg/g、8.74 mg/g、8.67 mg/g，平均值為8.72 mg/g。結果分析見表5，試驗值與理論值無顯著性差異。

表5 驗證試驗結果分析

3 討論

在選擇提取溶劑時考察了乙醇、甲醇兩種溶劑，發現防己中漢防己甲素和漢防己乙素在甲醇中提取率低，這是由于兩種生物堿為雙芐基異喹啉類生物堿，堿性較強，容易結合氫離子成鹽，在甲醇中溶解率低[7]。

用乙醇進行超聲提取防己藥材僅得到漢防己甲素和漢防己乙素的粗提物，需進一步純化才能得到高純度的漢防己甲素和漢防己乙素。楊欣欣等采用AB-8大孔樹脂法進行分離純化，但漢防己甲素和漢防己乙素的純度僅為50%[8]。魏晉寶等采用回流提取、萃取、氧化鋁色譜柱層析、重結晶法得到了高純度的漢防己甲素[9]。

本實驗采用響應曲面法考察乙醇體積分數、料液比及超聲時間對提取效果的影響。Design expert 10預測得到漢防己甲素最佳提取工藝為乙醇濃度為60%，料液比為1∶36.07，超聲時間為57.12 min，提取率為13.53 mg/g；最佳提取漢防己乙素的提取工藝為乙醇濃度62.49%，料液比為1∶37.71，超聲時間為59.38 min，提取率為8.71 mg/g，驗證值與預測值相近，本實驗的提取工藝及含量測定研究均為其今后的質量控制提供依據。