基于網絡藥理學方法探討六君子湯抗肺癌的作用機制

彭陳文 孫茗威 何沛聰 王 森 黃 璇 黃雅麗 張 韌*

1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東 廣州 510006

肺癌對人類的生命健康威脅巨大。由于吸煙、空氣污染等因素，近年來肺癌的發病率與死亡率持續上升，在我國，肺癌已經成為發病率與死亡率均為第一位的惡性腫瘤[1]。近年來化療藥物聯合中藥已成為治療肺癌的最佳模式。“虛則補其母”，中醫藥多以培土生金法治療肺癌，補脾以養肺，固護正氣。據臨床文獻報道，健脾理氣法能夠提高和改善肺癌患者的臨床療效和生活質量[2]。六君子湯(Liu Junzi Soup,LJS)具有健脾益胃、化痰祛濕、調暢氣機的功效，臨床上用于晚期肺癌的治療取得了良好的療效[3]，但其抗肺癌的具體機制尚不明確。

近年來興起的網絡藥理學研究思維具有整體性與系統性，這與中醫藥多成分、多靶點、多途徑協同作用特點相吻合[4-5]，因而適合用于中藥方劑作用機制的研究。本文基于網絡藥理學對LJS抗肺癌作用機制進行探討，為其作用機制的深入研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 LJS活性成分遴選 將LJS藥物名稱(人參、茯苓、白術、甘草、陳皮、半夏)輸入到TCMSP數據庫“Herb name”搜索欄里，下載六君子湯相關藥物活性成分的txt文本，將txt文本引入到excel表格中，獲得LJS藥物成分信息。使用口服生物利用度(OB值)大于20%和藥物相似性(DL值)大于0.18的限定條件對得到的藥物活性成分進行篩選，進而得到LJS活性成分。

1.2 LJS活性成分的靶點預測 將LJS活性成分導入PubChem數據庫，獲得化學成分的“Canonical SMILES”，然后將每一成分的“Canonical SMILES”輸入到Swiss Target Prediction靶點預測平臺，預測LJS活性成分的潛在作用靶點。

1.3 LJS抗肺癌相關靶點收集 通過Therapeutic Target Database (TTD)、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)、Disease Gene Search Engine (DiGSeE)、Drug Bank及Human Phenotype Ontology(HPO)5個疾病靶點數據庫，以關鍵詞“Lung Cancer”進行檢索，獲得肺癌相關的疾病靶點，除去重復靶點。將收集到的疾病靶點與1.2項下獲得的成分作用靶點進行對比，最后得到LJS抗肺癌相關作用靶點。

1.4 LJS抗肺癌的靶蛋白相互作用網絡(PPI)構建 將1.3項收集到的LJS抗肺癌的作用靶點輸入到Sring數據庫，獲取靶蛋白相互作用數據，使用Cytoscape3.2.1軟件構建PPI網絡，篩出degree值排名前10的靶點。

1.5 靶點的KEGG通路富集分析 登陸Metascape平臺，輸入LJS抗肺癌作用靶點，選項“Input as species”和“Analysis as species”均選擇“人類(Homo sapiens)”，P值設為小于0.01，對靶蛋白進行KEGG通路富集分析，根據結果數據中每個條目的P值從小到大進行排序，篩選前10條目，并進行數據可視化處理。

2 結果

2.1 LJS活性成分篩選 通過OB>30%，DL>0.18的篩選條件，共得到85個活性成分。半夏12個，包括黃芩素、黃芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇等；陳皮4個，包括川陳皮素、柑橘素等；白術7個，包括白術內酯、β-香樹素、長葉烯、等；茯苓15個，包括茯苓酸、松苓新酸等；人參19個，包括山奈酚、高麗槐素、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rg2等；甘草28個，包括槲皮素、毛異黃酮、黃甘草異黃酮A等。

2.2 LJS活性成分靶點預測 通過Swiss Target Prediction平臺，刪除重復項后，共獲得178個活性成分靶點。將178個作用靶點與OMIM、 TTD、DiGSeE、Drug Bank、以及Human Phenotype Ontology(HPO)5個疾病數據庫收集到的肺癌相關基因靶點進行比對，最終得到59個LJS抗肺癌的相關靶蛋白。

2.3 59個靶點PPI網絡分析 將59個靶點的蛋白質相互作用關系數據輸入Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶點PPI網絡圖，如圖1所示。此網絡共有59個節點，459條邊(“邊”表示兩個靶點存在相互作用關系)，靶點的degree值越大則形狀越大。該網絡中degree值排名前10的靶蛋白，分別為絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、熱休克蛋白90α(HSP90α)、信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體1(ESR1)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、雄激素受體(AR)、基質金屬蛋白酶 9(MMP9)。

2.4 KEGG通路富集分析 使用Metascape平臺對LJS抗肺癌的59個作用靶點進行KEGG通路富集分析，篩選前10條目(P值從小到大進行排序)，并進行可視化處理，結果如圖2所示.主要有PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、白介素17信號通路、血管內皮生長因子信號通路等。

3 討論

3.1 LJS抗肺癌涉及的重要藥物成分 研究結果表明，黃芩素、白術內酯、茯苓酸、人參皂苷等是LJS藥物活性成分。黃芩素對肝癌、乳腺癌以及宮頸癌等多種腫瘤細胞有明顯抑制細胞增殖的作用[6]。研究表明[7]，黃芩素對肺癌細胞的增值具有一定抑制作用，其可能通過上調Caspase - 3蛋白的表達與下調urvivin蛋白和Eph A2蛋白的表達來誘導肺癌細胞凋亡。白術內酯是白術的主要成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種作用[8]。研究顯示[9]，白術內酯可通過抑制TLR4/MyD88通路降低肺癌細胞侵襲能力與增值能力。人參皂苷是人參的有效成分，其可通過多種途徑增強機體對腫瘤細胞的免疫能力，具有明顯的抗腫瘤能力[10]。實驗表明[11]，人參皂苷可顯著抑制小鼠非小細胞肺癌細胞Lewis細胞中免疫檢查點程序性死亡分子1配體(PD-L1)的表達，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，阻斷由PD-L1介導的腫瘤細胞免疫逃逸，加強T細胞的免疫應答功能，抑制腫瘤細胞生長。

3.2 LJS抗肺癌涉及的重要作用靶點 LJS抗肺癌作用靶點PPI網絡結果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、熱休克蛋白90α(HSP90α)、腫瘤壞死因子(TNF)，基質金屬蛋白酶 9(MMP9)等10個靶點的Degree值排在59個靶蛋白前10位。AKT被認為是一種癌基因，可通過多種途徑參與調節細胞生長、代謝和凋亡。AKT1是AKT的重要亞型，與胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤發病密切相關。王嘉等[12]研究顯示，AKT1在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于肺泡對照組和支氣管對照組，提示AKT1在肺癌的發生過程中起促癌作用。HSP90α是一種熱休克蛋白，能與腫瘤細胞內的癌基因結合，維持其致癌性，且分泌到細胞外的HSP90α可增強腫瘤細胞的侵襲與遷移[13]。

3.3 LJS抗肺癌涉及的重要生物通路 KEGG信號通路結果顯示，LJS抗肺癌涉及PI3K-Akt、白介素17、血管內皮生長因子等信號通路。PI3K-Akt信號通路是機體內主要通路之一，其在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等[14]。倪琛琛等[15]研究100例肺癌組織中PI3K及Akt蛋白的表達情況，結果顯示前兩者在肺癌組織的陽性表達率均顯著高于相應癌旁組織的陽性表達率。血管內皮生長因子(VEGF)是一種活性很強生長因子，對血管的發生與形成具有促進作用。多種惡性腫瘤中VEGF的表達水平與患者5年存活率呈負相關，腫瘤細胞通過分泌VEGF誘導內皮細胞增值和血管形成，促進腫瘤的增殖與轉移[16]。

本研究結果顯示，LJS抗肺癌的過程涉及了多個活性成分、靶點及通路，與中醫藥診療疾病多成分-多靶標-多通路的特點相符合，可作為LJS抗肺癌作用機制的預測探討，為下一步實驗研究提供思路與參考。