人羊膜間充質細胞誘導成骨修復牙槽突裂的實驗研究

王芳 宋慶高 郭佳男 何葦 陳尚 鄒亞莉

(遵義醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，貴州 遵義 563000)

先天性牙槽突裂是口腔頜面部最常見的出生缺陷之一，常伴有唇腭裂的發生。研究[1-2]顯示，每4個唇腭裂患者中就有3個合并有牙槽突裂。牙槽突裂的修復在現階段臨床應用最多的方法是二期自體松質骨移植修復。但具體到臨床個體病例上，往往由于裂隙周圍軟組織量不足或者裂隙過大等原因造成植入骨的暴露導致骨移植修復失敗，有時甚至根本無法采用植骨的方法，同時還面臨在年幼患者中難以獲得足夠的骨量甚至需要開辟第二術區的風險。另外，由于移植骨的吸收，還有需要二次手術甚至多次手術的風險。本課題組前期實驗已經將hAMCs分離培養，并在體外成功誘導為成骨細胞，而且該細胞在與膠原—明膠海綿復合培養的過程中生長良好。本研究旨在探討應用經誘導分化成骨的hAMCs與明膠海綿載體復合培養后進行移植修復兔牙槽突裂的實驗效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 購于遵義醫科大學實驗動物中心健康成年雄性大白兔40只(1.5～2.0 kg/只)。

1.2實驗試劑與儀器 本課題組預制的未誘導成骨和已誘導成骨并搭載于膠原—明膠海綿進行復合培養的hAMCs，鼠抗人細胞核抗體(美國Sigma公司)，鼠抗人波形蛋白抗體(美國Sigma公司)，自動顯微照相裝置(PM20-35，日本Olympus公司)。

1.3牙槽突裂動物模型的建立與修復 用1%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經實驗動物耳緣靜脈注射麻醉后，口內外以碘伏消毒，鋪巾，切開牙齦，暴露左右上中切牙和側切牙遠中牙槽突骨面，用牙科電鉆在中切牙及側切牙遠中磨除牙槽骨至形成約1.0 cm×0.5 cm的楔形牙槽突裂樣缺損，缺損距側切牙切緣1.0 cm，縫合創口，形成一個雙側完全性牙槽突裂動物模型。待牙槽突裂兔傷口愈合后，1%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，常規消毒鋪巾，沿原切口切開，暴露牙槽突，根據對牙槽突裂不同的移植處理，將牙槽突裂兔隨機分為四組：A組(植入負載有hAMCs的膠原—明膠海綿，12只)；B組(植入負載有經誘導成骨的hAMCs的膠原—明膠海綿，12只)；C組(植入未作處理的膠原—明膠海綿，12只)，D組(空白對照，5只)。所有動物在術后半流質飲食1周，之后常規顆粒飼料喂養。

1.4實驗標本收集與處理 實驗動物于移植后2、4、6、8周分別注射過量戊巴比妥鈉，每次處死2只，第12周處死剩余動物，取下動物顱骨(含上頜骨，顴骨及鼻骨等)，剔除軟組織，在骨標本上應用游標卡尺直接測量上頜前部移植區牙槽骨厚度。取3次測量的平均值進行統計學分析。將左側移植區外0.2 cm范圍內包括骨，骨膜及肌肉切取下來，4%多聚甲醛固定24 h后，再采用10% EDTA-2Na脫鈣4周，石蠟包埋，切片，進行蘇木精—伊紅染色及抗人細胞核抗體免疫組織化學檢測。

2 結 果

2.1牙槽突裂修復大體觀察與測量結果 實驗動物術后出現術區局部輕度紅腫，3～5 d后基本消失，創口均無明顯的感染。大體標本觀察：A/B/C組術后2周，缺損均清晰可見，缺損內明顯纖維結締組織長入，A/B組未見明顯膠原—明膠海綿樣組織；術后4周，A/B組缺損變淺，缺損底部骨質疏松，易剝離，C組缺損邊緣變圓鈍，缺損未見明顯變淺；術后6周，A/B組缺損明顯變小變淺，缺損內有較多疏松骨質，而C組缺損稍變淺，缺損內側見少量松軟骨質；術后8周，A/B組骨面粗糙，缺損處見大量骨質充填，質地較正常骨質松軟，骨缺損交界處近骨質連續，C組缺損處也進一步變小和骨折增多，但缺損仍可見；術后12周，A/B組骨面較光滑，缺損處大量骨質充填，中切牙牙根未暴露，C組骨面粗糙，缺損處也見骨質充填，但仍存在凹陷，D組缺損內側少許骨質沉積，缺損變淺，中切牙牙根暴露或僅有少許骨質包繞。第12周各組新成骨平均厚度為：A組(4.51±0.43) mm、B組(4.38±0.66) mm、C組(3.19±0.12) mm、D組(3.08±0.09) mm。A組與B組的結果差異無統計學意義(t=-1.389，P>0.05)；A組與C組的結果差異有統計學意義(t=-9.468，P<0.01)；A組與D組的結果差異有統計學意義(t=-9.795 4，P<0.01)；B組與C組的結果差異有統計學意義(t=5.598，P<0.05)；B組與D組的結果差異有統計學意義(t=5.981，P<0.05)；C組與D組的結果差異有統計學意義(t=2.795，P<0.05)。

2.2牙槽突裂修復蘇木精—伊紅染色結果觀察 蘇木精—伊紅染色光鏡觀察結果示A組在術后2周成骨細胞不均勻聚集，有新生毛細血管，但沒有見明顯的鈣質沉積(圖1A)；術后4周，成骨細胞聚集區細胞和新生毛細血管均較術后2周增多(圖1D)；術后6周，成骨細胞聚集區范圍增大，細胞數也較前明顯增多，明顯鈣質沉積，類骨質形成(圖1G)；術后8周，鈣質沉積進一步增多，見新生骨小梁形成(圖1J)；術后12周，成熟骨質增多，但骨小梁排列排列較紊亂，仍可見成骨細胞聚集區(圖1M)。B組在術后2周視野內細胞較多，見紅染的鈣質沉積區及新生血管，還可見炎細胞浸潤(圖1B)；術后4周，見成骨細胞聚集區，鈣質沉積區鈣質沉積明顯，類骨質形成，新生毛細血管和炎細胞較術后第2周減少(圖1E)；術后6周，新生骨質較術后第4周明顯成熟，見新生骨小梁(圖1H)；術后8周，新生骨質較術后第6周更為成熟，新生骨小梁增多(圖1K)；術后12周，與術后8周及A組同時期比較，骨小梁排列整齊(圖1N)。C組在術后2周骨外側視野見散在細胞，未見明顯成骨細胞聚集區(圖1C)；術后4周，骨外側見細胞成分稍增多，仍未見明顯成骨細胞聚集區，脂肪細胞較術后2周增多(圖1F)；術后8周，骨外側見細胞成分較術后4周增多，見成骨細胞聚集和鈣質沉積(圖1L)；術后12周，骨外側見大量脂肪細胞(圖1O)。

圖1 A/B/C組在第2/4/6/8/12周時的蘇木精-伊紅染色結果(×200)

2.3牙槽突裂修復后抗人細胞核抗體免疫組織化學染色結果 本實驗對12周標本進行免疫組織化學染色結果顯示：A組B組均可見細胞核呈陽性染色的細胞存活(箭頭所指)，而C、D組均未見抗人細胞核抗體陽性染色的細胞(圖2)。

注:A組B組均可見細胞核呈陽性染色的細胞存活(箭頭所指)，C、D組均未見抗人細胞核抗體陽性染色的細胞。圖2 第12周A/B/C組免疫組織化學染色結果(×400)

3 討 論

牙槽突裂的良好重建可以使上頜牙弓的完整性及上頜骨的穩定性得以穩定有效的恢復，而且還能矯正鼻底塌陷、關閉口鼻漏，為之后二期的正畸、正頜打下堅實的基礎[3]。因此，牙槽突裂的重建一直是唇腭裂序列治療的重要組成部分，隨著近年來組織工程技術的興起，也為牙槽突裂的骨修復提供了新的策略和途徑[4]。與傳統的自體髂骨松質骨移植相比較，組織工程修復不僅可以明顯減少患者的痛苦和總體費用，還可以避免第二術區的開創及其所導致的不良反應。在之前的研究中，本課題組已經成功將hAMCs分離培養，并在體外誘導為成骨細胞，同時發現該細胞能夠搭載于膠原—明膠海綿上，且生長良好，可以與膠原—明膠海綿形成復合體。但hAMCs與膠原—明膠海綿復合體在體內的修復效果尚需不清楚，故我們決定通過建立兔的牙槽突裂模型，然后將該復合體移植于兔牙槽突裂處，觀察其修復效果。

本實驗研究運用牙科渦輪手機切割的手術方式在兔的上頜骨制造一個1.0 cm×0.5 cm大小的缺損，以此建立一個兔的牙槽突裂動物模型，且缺損大小符合兔頜骨的臨界缺損[5-7]，造模1個月后X-Ray攝片顯示裂隙存在，表明模型構建成功，之后采用hAMCs與膠原—明膠海綿復合體、經誘導后的hAMCs與膠原—明膠海綿復合體、未作處理的膠原—明膠海綿分別修復實驗動物的牙槽突裂。目前對于牙槽突裂修復效果評價的方法最常用的是由Bergland等[8]在1986年提出：即根據植入牙槽突裂間隔內的植入骨高度與正常牙槽嵴高度的比例變化，將評價結果分為四型。Ⅰ型：植入骨高度具有與正常牙槽嵴一致的高度；Ⅱ型：植入骨高度達到正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅲ型：植入骨高度低于正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅳ型：植入骨與牙槽突裂缺損區無骨性粘連，也就是植骨失敗。根據這一標準，可在較長的一段時間內對牙槽突植骨術術后的植入骨生長情況進行評價。但是因為本研究的實驗動物是兔，而兔的腭部較為扁平，沒有明顯的牙槽突，所以此方法并不適合，故本實驗采用測量第12周牙槽突缺損區骨厚度來評價牙槽突裂的修復效果，即在12周后對移植區骨厚度進行統計學分析，結果顯示A組與B組最終效果上沒有明顯統計學差異。但是蘇木精—伊紅染色后觀察經誘導后的hAMCs鈣質沉積較早。A組與C/D組的結果差異有顯著統計學意義；B組與C/D組的結果差異有顯著統計學意義。大體標本觀察，A、B 兩組裂隙間見大量骨質充填，裂隙得到修復，而C組見裂隙內側有骨質充填，但是骨面粗糙，缺損處仍凹陷；D組見中切牙牙根暴露，裂隙變淺存，內側見薄層骨質；C/D兩組同樣觀察到缺損淺的想象，這可能與缺損內側骨膜為切除，骨膜內的成骨細胞修復的結果。此外，我們通過免疫組織化學染色對第12周的樣本進行檢測，A/B組檢測到抗人細胞核抗體染色陽性的細胞，但兩組間的結果差異無統計學意義，可兩組與C組相比，結果差異都有統計學意義，說明了hAMCs及誘導后的hAMCs能夠負載于膠原—明膠海綿上并參與了體內成骨及骨重建，為將來人類牙槽突裂的修復重建提供新的策略和途徑，但其具體機制有待進一步研究。

本文圖1，圖2見封三。