花生紅衣多酚-鋅配合物的制備及其抗氧化性質

王翠蓮，武曉煒，陽嘉，姜欣伶，王越，李海燕*

魯東大學食品工程學院（煙臺 264025）

花生紅衣是花生加工的副產物，我國每年在花生加工過程中產生的花生紅衣總量近千噸，資源豐富。花生紅衣除少量用作中藥外，大多數被當作廢棄材料制成動物飼料，經濟價值非常低[1]。花生紅衣中含有豐富的多酚類物質，這些多酚類物質具有很好的生物活性，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等[2-4]。

多酚分子結構中含有多個酚羥基，可以發生醚化、苷化等反應，能與金屬離子發生螯合作用。有研究表明，多酚成分與金屬離子結合后，其生物活性得到顯著增加，甚至可以產生新的藥理作用[5-7]。多酚螯合鋅與氨基酸螯合鋅類似，分子量較小，較易通過腸壁從而被人體吸收，且不受外界環境pH影響，即使在胃部pH較低條件下，依然能穩定存在而不被分解，最終被人體所利用吸收，具有極高生物效價[8-10]。花生紅衣多酚與金屬離子的螯合作用還未見相關報道，花生紅衣多酚與金屬離子的配合物可能同時兼有多酚與金屬離子的生物活性，從而使得花生紅衣多酚的應用更加廣泛。

試驗利用超聲波輔助法乙醇提取花生紅衣多酚，將多酚與Zn2+進行配位，制備花生紅衣多酚-Zn配合物（PSP-Zn），并研究其抗氧化性質。為花生紅衣多酚更好應用于醫藥、食品等行業提供理論支持[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣（山東魯花集團）；DPPH（分析純，上海如吉生物科技發展有限公司）；硫酸鋅（分析純，天津市廣成化學試劑有限公司）；大孔吸附樹脂AB-8（分析純，天津浩聚樹脂科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

低速大容量離心機（LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠）；旋轉蒸發器（RE-52B，上海亞榮生化儀器廠）；可見分光光度計（721G，上海圣科儀器有限公司）。

1.3 花生紅衣多酚的提取、純化及含量測定

1.3.1 花生紅衣多酚的提取

花生紅衣多酚提取工藝參考劉曉艷等[11]和任虹等[12]的研究。具體操作為：將花生紅衣粉末過40目篩備用。準確稱取1.0 g花生紅衣粉末，放于燒杯中，按料液比1∶90（g/mL）加入體積分數56%的乙醇試劑，在超聲功率240 W條件下超聲25 min進行多酚提取，提取結束后離心提取液，去掉殘渣，取上清液進行旋蒸，除去提取液中的乙醇。將旋蒸后的提取液轉移于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，備用。

1.3.2 花生紅衣多酚的純化

取40 mL活化后的濕樹脂裝柱，將多酚粗提液進行上樣，充分吸附3 h，用2倍樹脂體積的蒸餾水以1.5 mL/min流速洗去雜質，之后分別用20%、60%的乙醇溶液以1.5 mL/min的流速進行梯度洗脫，收集洗脫液，旋蒸除去乙醇后，真空干燥得到花生紅衣多酚（PSP），經測定PSP多酚含量達80%。

1.3.3 花生紅衣多酚含量的測定

參照酒石酸亞鐵比色法。量取1 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入4 mL與提取時相同濃度的乙醇溶液，搖勻后加入5 mL酒石酸鐵溶液，搖勻。用pH 7.5的緩沖液定容，充分混合，靜置30 min顯色后，測其在波長540 nm處的吸光度。

1.4 PSP-Zn的制備及螯合率的測定

1.4.1 PSP-Zn的制備

按照一定的質量比加入與花生紅衣多酚質量濃度（1.2 mg/mL）相同的ZnSO4溶液，用玻璃棒充分攪拌使其完全反應。用檸檬酸和碳酸氫鈉將溶液調至一定的pH，在一定水浴溫度下螯合30 min后，在4 000 r/min的離心條件下離心10 min，除去沉淀物，收集上清液即為PSP-Zn[13-14]。

1.4.2 螯合率的測定

參照EDTA配位滴定法[15]滴定螯合物中的金屬元素。取5 mL質量濃度為1.2 mg/mL的PSP-Zn溶液，定容到25 mL容量瓶中，搖勻。加入3滴二甲酸橙指示劑，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，記下所消耗的溶液體積V0（mL）；另取相同體積的PSP-Zn溶液，加10 mL乙醇，水浴溫熱充分攪拌后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻。加3滴二甲酸橙指示劑，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，記下所消耗的溶液體積V1（mL）。通過式（1）計算出相應的金屬離子螯合率。

1.5 花生紅衣多酚螯合工藝的單因素試驗

1.5.1 反應溫度對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別加入30 mL質量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，調至pH 7.0。分別將5組螯合的反應體系置于30，40，50，60和70℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗。

1.5.2 pH對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別加入30 mL質量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，分別調至pH 4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，在40℃水浴條件下螯合30 min，以4 000 r/min離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗。

1.5.3 質量比對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別按質量比2∶1，3∶1，4∶1，5∶1和6∶1加入質量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，調節至pH 6.0，在40℃下螯合30 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗。

1.6 響應面優化PSP-Zn的制備條件

根據PSP-Zn制備的單因素試驗結果，選取反應溫度、pH、質量比3個因素作為自變量，以螯合率為響應值，根據Box-Behnken設計原理，做三因素三水平響應面分析試驗，以研究所選的3個因素對花生紅衣多酚與金屬離子螯合的綜合影響。響應面因素水平的設計情況如表1。

表1 PSP-Zn制備工藝響應面因素水平

1.7 抗氧化能力的測定

1.7.1 清除DPPH·能力的測定

用95%乙醇配制1×10-4mol/L的DPPH溶液備用。配制與相同濃度的PSP、PSP-Zn、VC、VE溶液。分別量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL樣品溶液于試管中，用蒸餾水補至1 mL，加入1×10-4mol/L的DPPH溶液3 mL搖勻靜置30 min后于517 nm下測吸光度A。用蒸餾水代替樣品，其他條件不變，作為對照測吸光度A0，計算清除率[16]。

1.7.2 清除羥自由基能力的測定

分別量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL PSP、PSPZn、VC、VE溶液于試管中，用蒸餾水補至1 mL，依次加入1 mL濃度為0.15 mol/L FeSO4溶液，1 mL濃度為2 mmol/L水楊酸溶液、1 mL濃度為6 mmol/L的過氧化氫溶液，在37℃下反應1 h，測定510 nm處的吸光度A；用蒸餾水代替上述樣液，其他條件不變，測吸光度A0，計算清除率。

2 結果與分析

2.1 反應溫度對PSP-Zn制備的影響

反應溫度對PSP-Zn制備的影響如圖1所示。在一定溫度范圍內，螯合率隨反應溫度增加而提高，多酚與Zn2+螯合率在60℃時達到最大，最大值分別為44%。花生紅衣多酚與金屬的螯合體系溫度達到最佳溫度后，金屬離子的螯合率呈現下降趨勢。這可能是由于較高溫度破壞多酚與Zn2+之間起螯合作用的化學鍵，從而使螯合率下降。

圖1 溫度對PSP-Zn制備的影響

2.2 pH對PSP-Zn制備的影響

由圖2可知，在酸性范圍內，螯合率隨pH升高呈上升趨勢，說明酸性條件有利于花生紅衣多酚與金屬螯合反應進行；反應體系pH 6.0時，多酚與Zn2+的螯合率達到最大值45%。反應體系呈堿性時，多酚與金屬離子的螯合率急劇下降。出現這種現象的原因是由于多酚的獨特分子結構，它可在電解液中電離出較多的氫離子，使整個反應體系呈現酸性。在堿性環境中，OH-一方面可與氫離子結合，促使平衡反應向右進行，促進更多多酚物質降解；另一方面OH-本身可與Zn2+結合生成沉淀，從而減少多酚與金屬離子之間螯合物生成。

圖2 pH對PSP-Zn螯合反應的影響

2.3 質量比對PSP-Zn制備的影響

質量比對PSP-Zn的螯合率影響如圖3所示。隨著金屬離子與多酚質量比增大，螯合率呈現逐漸上升趨勢，直至達到最佳螯合率后呈現基本保持不變或者下降趨勢。多酚與Zn2+的螯合率在質量比3∶1時達到最大值47%，而后變化趨勢趨于平穩。

2.4 響應面優化PSP-Zn的制備條件

2.4.1 因素分析及模型建立

花生紅衣多酚與Zn2+螯合反應的響應面因素水平的試驗結果如表2所示。

利用Design Expert軟件對表2數據進行分析后，各試驗因子對響應值的影響可用函數表示為Y=49.96- 0.38X1-2.15X2+1.09X3-1.46X12-7.68X22-2.06X32+ 0.82X1X2-0.50X1X3+0.62X2X3。

圖3 質量比對PSP-Zn螯合反應的影響

表2 PSP-Zn制備工藝響應面設計及試驗結果

對17個試驗點的響應值進行回歸分析后得到的方差分析表如表3所示。

由表3可知，各因素對多酚與金屬的螯合率的影響是不同的，各因素對模型影響程度大小依次為X2＞X3＞X1，即pH影響最大，溫度影響最小。

表3 各因素方差分析

2.4.2 響應面分析

由表3可以看出，模型的回歸顯著性水平小于0.05，說明多酚與鋅離子的螯合率與溫度、pH、質量比之間的關系顯著，而失擬項不顯著，說明該方程與實際情況擬合很好。從分析結果可以看出，溫度（X1）、pH（X2）及質量比（X3）這3個因素p值只有因素pH的p＜0.01，說明這3個因素對多酚與鋅離子的螯合率的影響情況有很大差別，只有pH顯著突出。

利用響應面分析法對回歸模型進行分析后，因為失擬項顯著，從而試驗得不到最優工藝條件。所有利用Design Expert軟件得出PSP-Zn制備的最優工藝條件：反應溫度57.82℃、pH 5.86、質量比3.27∶1，最大螯合率為46.30%。

圖4～圖6給出利用響應面進行優化時，固定一個因素時，另外2個因素的交互作用對螯合率的影響情況的響應面3D圖和等高線圖。等高線為圓形時說明兩個因素的交互作用不顯著，為橢圓形時則說明這2個因素的交互作用顯著。溫度、pH、質量比這3個因素的交互作用均為顯著。

圖4 溫度與pH的交互作用對PSP-Zn制備的影響

圖5 溫度與質量比的交互作用對PSP-Zn制備的影響

圖6 pH與質量比的交互作用對PSP-Zn制備的影響

2.5 PSP-Zn的抗氧化活性研究

2.5.1 PSP-Zn清除DPPH自由基的活性

DPPH自由基的電子可以與抗氧化劑反應從而降低自由基濃度[17-19]，PSP-Zn中游離羥基數目影響其與DPPH自由基結合的反應速度[20]。花生紅衣多酚的提取液（PSP）、VC、VE溶液及PSP-Zn清除DPPH自由基能力如圖7所示。

結果表明，所有樣液均具有一定清除DPPH自由基能力，且清除能力與自身濃度呈正比，即濃度越高，清除能力越強。質量濃度為1 200 μg/mL時，PSP-Zn對DPPH清除率為84%，明顯高于PSP的70%，說明PSP螯合鋅離子后清除DPPH能力顯著提高。與同濃度VC和VE相比，PSP-Zn的清除DPPH能力也較強。總體上來說，多酚及其金屬配合物清除DPPH自由基的能力要高于VE、VC溶液且清除能力較強。

圖7 PSP-Zn對DPPH自由基的清除能力

2.5.2 PSP-Zn清除羥自由基的活性

羥自由基幾乎能與活細胞內的所有物質發生反應，是危害性很大的活潑性氧自由基之一[21-23]。由圖8可知，PSP-Zn清除羥自由基的能力與未螯合前PSP相比有所下降，即二者濃度相同時（1 200 μg/mL），PSP-Zn對羥自由基清除率為23.40%，低于PSP對羥自由基清除率27.71%。同濃度的VC、VE溶液的清除能力要明顯高于PSP和PSP-Zn。

圖8 PSP-Zn對羥自由基的清除能力

總體上來說，多酚及其多酚金屬配合物在清除羥自由基方面的能力要弱于清除DPPH自由基的能力。分析其原因可能是，試驗過程采用的是花生紅衣多酚粗提物，含有其他雜質，影響金屬的配合及產物的抗氧化性質。此外，植物多酚的酚羥基及其多酚分子結構的獨特性使其具有抗氧化活性[23-25]，花生紅衣中多酚種類及結構也復雜不同，有關其金屬配合物結構及抗氧化作用機制還需進一步研究。

3 結論

試驗選用山東煙臺當地花生加工副產物花生紅衣為原料，采取超聲波輔助乙醇提取花生紅衣多酚。將提取的花生紅衣多酚與Zn2+進行配位，制備花生紅衣多酚-Zn2+配合物（PSP-Zn），并考察影響金屬螯合率的3個因素：溫度、pH、質量比。通過單因素和響應面試驗確定最佳螯合條件。結果表明，PSP-Zn的最佳制備工藝為：反應溫度57.82℃，pH 5.86，質量比4.27∶1。多酚與鋅離子的最大螯合率為46.30%。

PSP-Zn的抗氧化性質研究結果顯示，在清除DPPH自由基能力方面，PSP-Zn有較強的清除能力，高于同濃度VC、VE溶液，且隨著濃度升高，清除能力呈上升趨勢；而在清除羥自由基能力方面，PSP和PSP-Zn的清除能力都要低于同濃度VC、VE溶液，且PSP-Zn的清除能力要略低于PSP。PSP-Zn的性質及構效關系還需進一步研究。PSP-Zn的制備和抗氧化性質研究可為新型抗氧化劑的開發提供思路，也為花生紅衣的高值化利用提供試驗依據。