正交優化超聲輔助雙水相法粗提雪菊色素

李娜，夏娜，王玉濤，朱思明, *

1. 喀什大學生命與地理科學學院（喀什 834000）；2. 華南理工大學食品科學與工程學院（廣州 510641）

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）學名蛇目菊，為高寒野生植物，有極高藥用價值。中藥記載雪菊有解毒、化瘀及健脾的功效；現代研究發現，雪菊有降脂、將壓、降糖、改善胰島素敏感性等藥理作用[2]。此外，雪菊有養生、保健功能，泡茶可治口渴、腸胃不適、痢疾、瘡癤等[3]。國內外研究者在雪菊理化性質、栽培等方面開展大量研究，取得一定成果，為開發雪菊經濟價值提供理論指導。

雪菊的提取方法包括水或醇浸提、回流、超聲、微波、超臨界、亞臨界水技術，并輔助響應面優化、隨機質心映射優化、正交等技術研究最佳提取工藝?？傸S酮含量測定方法主要有ZrOCl2法、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法、AlCl3、HCl-Mg粉法、差示分光光度法、FS、TLCS、HPLC及毛細管電泳等。有研究表明，差示分光光度法測定結果與HPLC法相符，表明該法測定結果準確，操作簡單，有良好的穩定性、重復性[13]。因此，試驗采用差示分光光度法，試驗發現，標準品和樣品的最大吸收波長不一致，對2種波長下所得數據進行擬合，測定樣品含量。

因傳統雙水相技術所用聚合物黏度大、成本高、效率低、目標物回收處理困難[5]，應用受限。改進后的低級醇-鹽雙水相系統可攻克上述弊端，又有易于放大、可連續化操作、易集成及綠色環保及組成多樣等優點，被應用于天然代謝物的提取分離[5]。應用較多的是乙醇或正丙醇與無機鹽組成的雙水相體系，并輔助超聲、微波等技術優化分離工藝，不僅可以簡化分離工藝且提高分離效率。國內外關于雪菊色素提取的報道較少。此外，由于合成色素對環境、人體健康危害越來越大，天然色素的應用越來越普及，市場需求越來越大。近年來，雪菊已廣泛種植，因此合理開發雪菊的商業價值尤為重要。試驗以雪菊為研究對象，采取正丙醇（NPA）/硫酸銨構造雙水相系統（ATPS）輔助超聲波技術粗提雪菊色素，并借助正交試驗確定最優提取條件，研究雙水相應用于實際生產的可行性，為工業生產提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪菊（喀什市東巴扎市場）；蘆丁標準品（批號B20771，純度HPLC≥98%，Shanghai Yuanye Bio- Technology Co.，Ltd.）；正丙醇（分析純，Aladdin Reagent Co.，Ltd.）；硫酸銨（分析純，天津大茂化學試劑廠）；ZrOCl2·8H2O（分析純，阿拉丁試劑有限公司）；蒸餾水。

滴定管；移液管；分析天平（BSA223S，Sartorius Scientific Instruments Co.，Ltd.）；電子秤（JJ1000，常熟雙杰測試儀器廠）；容量瓶；超聲清洗儀；紫外可見分光光度計；0.45 μm水系針頭濾器、有機系針頭濾器（0.45 μm，25 mm；AMERITECH SCIENTIFIC）；分液漏斗；具塞磨口錐形瓶；量筒

1.2 試驗方法

1.2.1 雪菊預處理

純凈干燥的雪菊粉末，過20目篩，再過100目篩，分成2份，密封袋保存備用。

1.2.2 雙水相分相

一些小分子醇與一些無機鹽水溶液作用可形成ATPS。劉磊磊等[9]發現NPA的分相能力大于異丙醇、乙醇；對比K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4分相能力發現均能構成ATPS，其中(NH4)2SO4分相能力最佳，可于鹽量較少情況下分相，故試驗選擇NPA和(NH4)2SO4構造ATPS。采用濁點法繪制ATPE相圖，操作步驟為：精密稱取9.000 0 g左右的(NH4)2SO4于小燒杯中，滴定管加入一定體積的水（13.55 mL）至(NH4)2SO4溶解，形成(NH4)2SO4溶液；磁力攪拌器攪拌下，滴定管緩慢滴加NPA至溶液出現渾濁即為滴定終點，記錄NPA加入量；向體系加入一定體積的水至溶液澄清，記錄水的加入量，向澄清液滴加一定體積NPA至渾濁，記錄NPA加入量，如此反復操作，結果見圖1。

1.2.3 雪菊中色素的雙水相提取

準確稱取一定量(NH4)2SO4于250 mL具塞錐形瓶中，加定量蒸餾水，振蕩溶解；加入一定量NPA，建立總質量20.0 g NPA/(NH4)2SO4ATPS[5]，稱取一定量雪菊粉末加入到已構建的20.0 g體系中；用超聲清洗儀在一定溫度和時間下萃取。萃取結束，放置一段時間，等上下相完全分層，分液漏斗過濾，分別讀取上下相體積，分得的醇相和水相分別過有機濾膜和水膜。

1.2.4 單因素試驗

根據步驟1.2.3，分別研究(NH4)2SO4質量分數（25%，26%，27%，28%，29%和30%），NPA質量分數（20%，21%，22%，23%，24%和25%），雪菊粉末用量（0.02，0.04，0.05，0.06，0.08和0.10 g）、pH（1，3，5，7和9）、超聲溫度（20，30，40，50和60℃）及時間（20，40，60，80和90 min）6個因素對雪菊色素提取的影響。

1.2.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，對(NH4)2SO4質量分數、NPA質量分數、雪菊粉末用量、溫度、時間、pH進行正交試驗考察，每個因素3個水平，優選雪菊色素提取工藝，用正交設計助手（Latin）設計試驗方案，因素水平表如表1。

圖1 正丙醇/硫酸銨雙水相圖

表1 正交試驗因素水平表

1.2.6 雪菊色素含量測定

提取后的雪菊色素主要富集于上相，下相含量較少（對雪菊色素提取液上相和下相分別顯色，發現下相中色素含量很少，后續試驗采用上相溶液測量）。上相過0.45 μm有機濾膜，以總黃酮為指標測量雪菊色素含量。

1.2.6.1 蘆丁對照品溶液的制備

準確稱取蘆丁標準品10.3 mg，加少量60%乙醇，超聲溶解，轉移至50 mL容量瓶中，60%乙醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度0.206 mg/mL的蘆丁對照品儲備液。

1.2.6.2 蘆丁最大波長的測定

準確量取2份3 mL蘆丁儲備液于25 mL容量瓶中，一份加60%乙醇溶液稀釋至刻度做參比；另一份加4 mL質量分數2% ZrOCl2·8H2O乙醇液[13]，并用60%（質量百分數）乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻放置1 h，于波長范圍250～700 nm內掃描測定。結果顯示，顯色前后對照品在440 nm處有最大差示吸光度。另取雪菊色素供試品有機相溶液0.3 mL 2份，同上述步驟，掃描樣品絡合前后的差示吸收光譜。結果提示，雪菊色素樣品溶液顯色后在413 nm處有最大差示吸光度，由此發現，對照品和供試品溶液顯色后的差示吸收光譜不同，故分別測定對照品和供試品在413和440 nm處的吸收差值。

1.2.6.3 蘆丁標準曲線的制備

準確移取蘆丁儲備液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL各2份置于10 mL容量瓶中，同1.2.6.2法顯色，放置1 h，分別于413和440 nm處測定各組溶液顯色后差示吸光度，同一濃度下不同波長處的吸光度相減，并以此為縱坐標，以對照品溶液質量濃度為橫坐標（mg/mL），繪制標準曲線。

1.2.6.4 雪菊色素得率的計算

按方法1.2.3制備雪菊色素，取0.3 mL有機相溶液2份于25 mL容量瓶中，按1.2.6.2的方法顯色，靜置1 h，在413和440 nm處分別測定相應的差示分光光度值。按照回歸方程，通過吸收度差值計算被測液中色素含量。

式中：C為線性方程計算出的質量濃度，mg/mL；V0為分離后的醇相或水相體積，mL；V為測定所吸取稀釋液體積，mL；m為稱取的樣品質量，mg。

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線

按1.2.6.3的方法求得回歸方程為ΔA=7.253 8C+ 0.009 18（R2=0.993 71），表示蘆丁質量濃度在0.008 24～0.028 84 mg/mL之間，和相應的吸收度差值線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 (NH4)2SO4質量分數的影響

如圖2，在25%～28%范圍內隨(NH4)2SO4質量分數增加，雪菊色素得率呈現下降趨勢，可能是由于體系中(NH4)2SO4質量分數增加，鹽的助溶作用也增加，因此雪菊色素不斷富集于水相。(NH4)2SO4質量分數28%時，與水相體積相比，發現醇相體積相對減少，可能是由于此時分相能力較弱，色素大量溶解于水相或提取不充分，這與28%處色素得率低的結果一致。

2.2.2 正丙醇質量分數的影響

試驗結果見圖3，隨NPA質量分數增加，雪菊色素得率出現先下降后增加又逐漸下降現象，可能是由于NPA本身具有良好的分相能力，很大程度上影響雪菊色素的分離，隨著NPA含量增加，使得雪菊中更多的脂溶性物質等溶出，溶液中色素含量相對減少。

圖2 (NH4)2SO4質量分數對雪菊色素得率的影響

圖3 正丙醇質量分數對雪菊色素得率的影響

2.2.3 雪菊粉末用量的影響

從圖4可以看出，在雪菊粉末用量小于0.08 g，雪菊色素得率總體上呈現升高趨勢，這說明有利于雪菊色素的提取分離。雪菊粉末用量大于0.08 g，提取率出現減少趨勢，可能是因為隨著雪菊粉末加入增多，雪菊中大量的糖類、果膠等物質溶出，對雪菊色素的分離造成干擾，從而減弱雙水相對雪菊色素的分離。

圖4 雪菊粉末用量對色素得率的影響

2.2.4 超聲溫度的影響

由圖5可以看出，在前30 min，雪菊色素得率隨溫度升高而升高，30 min以后有所下降，可能是因為隨著溫度升高，糖類等多數成分均不同程度的溶出并分配到雙水相體系中，影響色素分離。但40 min以后雪菊色素得率有不同程度上升，可能隨溫度升高，雪菊細胞壁大量破裂，基質中色素大量擴散到溶液中；此外，隨溫度升高，分子熱運動逐漸加劇，色素物質在濃度差的作用下擴散到溶液中便越來越容易，因此得率相對增加。

圖5 溫度對雪菊色素得率的影響

2.2.5 超聲時間的影響

從圖6可知，40 min之前，雪菊色素得率隨著超聲時間增加逐漸增加，40～80 min之間，雪菊色素得率變化不大，可能在此時間段內，雪菊色素提取分離達到飽和。80～90 min時，得率有不同程度增加，可能因為時間越久，超聲越完全，分子運動產生的熱能逐漸升高，使得更多物質溶出，尤其結合型的色素類物質，故色素得率上升。

2.2.6 pH的影響

如圖7所示，pH對雪菊色素得率作用較大，在強酸條件下，雪菊色素得率隨pH增加而增加，可能是因為酸性條件利于結合型黃酮苷類物質的水解，使得溶液中游離的黃酮類物質增加；在堿性條件下，雪菊色素得率顯著降低，可能是因為，色素中大量黃酮苷類成分、蒽醌苷類等含有大量酚羥基的結構，因酚羥基的存在，一方面增強其酸性，使得水相中溶解度增大；另一方面，蒽醌苷類成分因其酚羥基和羰基的存在可在堿性條件下形成共軛體系，改變其化學結構，從而使溶液顯紅色或紫紅色，這在試驗提取結果中得到證實。因此強堿性條件下提取到的雪菊色素在水相含量增大，在有機相卻減少。

圖6 時間對雪菊色素得率的影響

圖7 pH對雪菊色素得率的影響

2.3 雪菊色素提取工藝正交優化試驗

按照上述結果，選取(NH4)2SO4質量分數（A）、NPA質量分數（B）、雪菊粉末質量（C）、溫度（D）、時間（E）、pH（F）進行六因素三水平正交試驗，L18(36)試驗設計與結果見表2。

表2 正交試驗結果

接表2

由極差R可以得出，影響雪菊色素得率的因素主次關系是F＞D＞C＞A＞B＞E。雪菊色素最佳提取條件為A3B3C2D3E1F1；開展重復試驗3次，結果如表3。結果顯示RSD為4.413%＜5%，平均得率為240.146 9 mg/g。這表明超聲輔助雙水相正交優化粗提雪菊色素，以總黃酮為測量指標，該工藝可行，重現性較好。

表3 重現性試驗結果

2.4 精密度試驗

準確移取3 mL 2份蘆丁儲備液于25 mL容量瓶中，根據1.2.6.2所述顯色，1 h后，于413和440 nm處測定絡合后的吸光度，結果如表4，顯示儀器精密度較好。

表4 精密度試驗結果

2.5 穩定性試驗

按最佳方案，開展穩定性試驗，按1.2.6.2法顯色。室溫下放置一定時間，測定吸光度，RSD是3.04%，說明供試品中雪菊色素在2 h內穩定，結果如表5。

表5 穩定性試驗結果

2.6 重現性試驗

按照2.3下重復試驗操作，測定其吸光度，計算RSD，結果見表4。RSD為4.413%，表明該方案可行，重現性較好。

3 結論與討論

研究正交優化超聲輔助NPA/(NH4)2SO4ATPS粗提雪菊色素的工藝條件。確定以總黃酮為指標時最佳工藝為：20 g ATPS中(NH4)2SO4質量分數29%，正丙醇質量分數23%，雪菊粉末用量0.08 g，溫度60℃，時間60 min，pH 3。驗證性試驗結果表明，差示分光光度法用于雪菊色素中總黃酮的檢測可行，雪菊色素得率為240.146 9 mg/g，總體來說高于文獻中雪菊總黃酮提取率[5,15,21]，但比邱佳俊[2]所用方法提取率58.95%顯著低，說明試驗還需要改進。此外，超聲輔助雙水相法粗提雪菊色素可以相對提高雪菊色素分離效率，且試驗所用溶劑較少，提取時間較短，安全綠色環保，所需工藝設備要求低，操作簡單，成本較低，為雪菊色素的工業生產提供一定理論基礎。