響應面法優(yōu)化福林酚法測定冬棗中總酚含量

林倩，吳昊，劉芊辰，邵娟娟*

1. 河北農(nóng)業(yè)大學理工學院（滄州 061100）；2. 河北農(nóng)業(yè)大學園藝院（保定 071000）

冬棗是一種屬于鼠李科的樹木果實，是一種兼具生態(tài)功能和經(jīng)濟功能的品種[1]，與其他品種的棗在成分組成、外型等方面有較大區(qū)別。冬棗中富含多酚[2]。多酚是植物的重要組分，有助于顏色、香氣的形成，同時也起到保護植物的作用[3]。多酚類化合物種類繁多，主要有黃酮、異黃酮、黃酮醇、兒茶素和酚酸的衍生物或異構(gòu)體，不同的結(jié)構(gòu)使多酚類化合物具有多種生物學特性，如抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、保護心血管等功能，被認為是一種有效的健康保護劑以及食品天然防腐劑[4]。因此檢測冬棗中這些生物活性化合物具有很大的意義。

目前，檢測多酚類化合物的方法主要有高效液相色譜法和福林酚法等。其中福林酚法更適合食品組分較為簡單的多酚的測定[5]，該方法同時具有靈敏度高、快速和可重復性良好等特點[6]，更加適合冬棗中多酚含量的測定。另外，多酚結(jié)構(gòu)的多樣性使得不同物質(zhì)中總酚的組成不相同，被檢測物質(zhì)中組成成分會影響測定結(jié)果[7]，并且組分含量及構(gòu)成對顯色反應結(jié)果的影響也有差別[8]。由于目前針對冬棗中多酚含量測定的研究主要針對多酚提取體系等方面，應用福林酚法測定冬棗中的總酚含量還未有所用試劑的定量標準[9]，影響了冬棗的開發(fā)利用，因此優(yōu)化福林酚法測定冬棗中總酚含量的工藝條件是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗：滄州市市售，無機械損傷，顆粒大小適中，成熟度均勻；沒食子酸標品（分析純）、福林酚試劑（生化試劑）：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；烘箱、電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（珀金埃爾默儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波長的選擇與標準曲線的繪制

參考張萍等[10]的方法。準確稱取10 mg沒食子酸標品，加水定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。用移液槍分別移取0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5和1.75 mL于25 mL容量瓶中，加入10 mL超純水搖勻，分別加入0.65 mL的福林試劑，避光反應后加入4 mL 20%碳酸鈉溶液，用超純水定容，于60℃水浴加熱10 min，冷卻后得到質(zhì)量濃度為0，1，2，3，4，5，6和7 μg/mL的沒食子酸系列溶液。將3 μg/mL的沒食子酸溶液在全波長下掃描，并設(shè)置空白對照，確定最大吸收波長，為720 nm。

在720 nm波長下對系列溶液進行吸光度測定，以沒食子酸濃度（μg/mL）作為X軸，吸光度作為Y軸，獲得標準曲線，求得方程為Y=0.096 8X-0.017 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸的標準曲線

1.3.2 冬棗多酚的提取

將新鮮冬棗人工去核后切片，參考杜丹丹等[11]的方法，將冬棗在烘箱內(nèi)以40℃的溫度恒溫鼓風干燥48 h，經(jīng)過加熱烘干以后，冬棗干中的多酚含量會有明顯上升[12-13]。用粉碎機將冬棗干粉碎為冬棗粉，然后置于不透明自封袋中低溫保存。準確稱取10 g冬棗粉末于錐形瓶中，加入100 mL體積分數(shù)50%的乙醇溶液，用保鮮膜封口，并將膜扎出若干小孔，放置于超聲波清洗機中，在60℃條件下提取1.5 h，經(jīng)過濾后的濾液以3 500 r/min離心20 min，獲得冬棗多酚溶液。準確吸取1.5 mL冬棗多酚溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線并搖勻。

1.3.3 冬棗多酚的單因素試驗

1.3.3.1 福林酚試劑濃度的確定

此方法通過還原福林酚試劑來形成藍色復合物[14]，因此選擇福林酚試劑濃度作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，分別加入1 mL 0.2，0.4，0.6，0.8和1 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入1.5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的碳酸鈉溶液，搖勻至于40℃的恒溫水浴鍋中，避光反應1 h，在720 nm處進行吸光度的測定，得到最佳福林酚試劑的用量，同時進行平行試驗。

1.3.3.2 碳酸鈉用量的確定

顯色反應在碳酸鈉介質(zhì)中進行，碳酸鈉的加入量會影響該方法，因此選擇碳酸鈉用量作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，加入1 mL 0.6 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入分別加入0.5，1，1.5，2和2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的碳酸鈉溶液，搖勻至于40℃的恒溫水浴鍋中，避光反應1 h，在720 nm處進行吸光度的測定，得到最佳的碳酸鈉用量，同時進行平行試驗。

1.3.3.3 反應溫度的確定

溫度會影響有色物質(zhì)的穩(wěn)定性以及碳酸鈉的溶解度，因此選擇溫度作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，加入1 mL 0.6 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，搖勻后分別至于20，30，40，50和60℃的恒溫水浴鍋中，避光反應1 h，在720 nm處進行吸光度的測定，得到最佳反應溫度，同時進行平行試驗。

1.3.4 冬棗多酚測定方法響應面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素的基礎(chǔ)上，選取福林酚試劑濃度、碳酸鈉用量、反應溫度3個因素，進行三因素三水平的響應面分析，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析過程中采用Origin 8軟件和Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理與繪圖，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進行響應面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 福林酚試劑濃度的影響

如圖2所示，福林酚試劑濃度對冬棗總酚測定結(jié)果的影響較大，隨著福林試劑濃度的上升，反應物的含量上升，染色反應進行得愈加充分，從而使得靈敏度上升，因此所測得的總酚含量是逐步增加的。在福林酚濃度逐漸增大的過程中，多酚與福林酚的反應趨于飽和，福林酚試劑濃度繼續(xù)增大，吸光度趨于平穩(wěn)。當濃度為1 mol/L時所測得吸光度最大，且隨著福林試劑濃度的上升，所測得的吸光度上升幅度降低，考慮到經(jīng)濟因素、靈敏度、線性范圍，試驗選擇0.8 mol/mL為最佳用量。

2.1.2 碳酸鈉用量的影響

如圖3所示，隨著碳酸鈉用量的增加，所測得的吸光度先上升后下降，且當碳酸鈉用量為1 mL時，測得的吸光度最高，當碳酸鈉的添加量大于1 mL以后，下降的趨勢會逐漸減小，且反應后的溶液中有白色沉淀的析出。因此將碳酸鈉的最佳用量確定為1 mL。

圖2 福林酚試劑濃度對吸光度的影響

圖3 碳酸鈉用量對吸光度的影響

2.1.3 反應溫度的影響

如圖4所示，隨著反應溫度的上升，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，溫度的上升為反應創(chuàng)造最佳的條件，這種急劇下降的趨勢可能是50℃以上的高溫會破壞生成的有色物質(zhì)[15]，造成吸光度下降。所以初步確定最佳反應溫度為50℃。

圖4 溫度對吸光度的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 響應面結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對選取的3個因素進行響應面分析，響應面試驗結(jié)果如表2所示。試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到總酚含量對福林酚試劑濃度（A）、碳酸鈉用量（B）、顯色溫度（C）的回歸模型方程：總酚含量（Y，μg/mL）=-71.948 75+ 83.920 00A+15.587 75B+2.034 91C-10.355 00AB-0.141 25AC-0.071 950BC-44.459 37A2-3.412 50B2-0.022 861C2。

表2 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件對選取的三個因素進行響應面分析，試驗結(jié)果的方差分析如表3所示。根據(jù)表3模型分析可知，二次回歸模型的F=48.36，p＜ 0.000 1，表明該模型達到極顯著水平；失擬項是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項p=0.870 9，p＞0.05，說明失擬項差異不顯著，能充分反映實際情況，回歸模型是適合的；試驗模型的決定系數(shù)R2=0.941 6，說明冬棗多酚測定條件結(jié)果與模型預測結(jié)果有著良好的一致性，試驗誤差較小，試驗模型的校正系數(shù)R2Adj=0.963 8，這也驗證了該模型的可靠?；貧w方程各項方差分析中F值檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此可知該試驗中設(shè)計的各因素對冬棗中多酚檢測影響的主次順序為B＞A＞C，即20%碳酸鈉的用量對冬棗中總酚測定的影響最大，其次是福林酚試劑的濃度，對其影響最小的是處理溫度。通過對回歸方程與方差分析還可以了解到模型一次項中碳酸鈉的用量對冬棗中總酚的測定結(jié)果影響極顯著，福林酚試劑的濃度對試驗結(jié)果的影響顯著，而反應溫度對試驗結(jié)果的影響不顯著，交互項中AB對結(jié)果的影響極顯著，AC、BC對試驗結(jié)果的影響不顯著，二次項中A2與C2對試驗結(jié)果影響極顯著，B2對試驗結(jié)果影響顯著。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應面中交互作用及優(yōu)化

多元二次回歸模型所作的響應面圖是通過Box- Behnken原理設(shè)計試驗得到的，響應面圖形反映的是各個因素之間的相互關(guān)系以及相互作用程度[16]。固定其他因素，考察交互項對冬棗中多酚測定的影響，響應面分析圖可用于評價該試驗中設(shè)置的試驗因素對冬棗總酚測定影響的兩兩交互作用[17]。各因素交互作用對響應值的影響如圖5～圖7所示。響應面坡度越陡峭，說明改變試驗條件對響應值的影響越顯著，該因素對冬棗中總酚測定的影響越大；反之則表明該因素對冬棗中總酚測定的影響越不顯著。在交互項對提取率的影響中，福林酚試劑濃度與碳酸鈉用量的交互作用顯著，其他因素之間交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 福林酚試劑濃度與碳酸鈉用量交互作用對總酚測定的影響

圖6 福林酚試劑濃度與反應溫度交互作用對總酚測定的影響

圖7 碳酸鈉用量與反應溫度交互作用對總酚測定的影響

2.2.3 最優(yōu)測定條件確定

利用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得到的最佳測定條件：福林酚試劑濃度為0.81 mol/L、20%碳酸鈉溶液用量為0.63 mL、反應溫度為40.03℃。得到的預估總酚測定值為509.498 μg/mL。參照最佳工藝條件，且將測定條件在實際操作中略作調(diào)整：福林酚試劑濃度為 0.8 mol/L、20%碳酸鈉濃度的用量為0.6 mL、反應溫度設(shè)為40℃，并進行平行試驗進行驗證，所測得的平均值為501±3.58 μg/mL，驗證試驗的結(jié)果低于表2中的最高值，但是與最佳條件下的總酚含量測定的預估值相近，且吻合度高達98.4%，這驗證了該測定條件的可靠性。

3 方法學考察

3.1 穩(wěn)定性試驗

準確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，加入0.8 mol/L福林酚試劑，30 s后加入0.6 mL 20%碳酸鈉濃度，置于40℃ 水浴鍋中反應1 h，取出后分別放置0，1，2，3和4 h，再進行吸光度的測試，所測得的吸光度分別為0.485，0.482，0.480，0.479和0.479。吸光度呈現(xiàn)下降趨勢，但下降的程度不大，在2 h以后趨于穩(wěn)定。這驗證了該方法的穩(wěn)定性。

3.2 重復性試驗

準確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，加入0.8 mol/L福林酚試劑，30 s后加入0.6 mL濃度為20%的碳酸鈉，置于40℃水浴鍋中反應1 h，并進行5次平行試驗，所測得的冬棗多酚含量分別為501，497.42，504.35，495.60，492.94和502.20 μg/mL，根據(jù)上述測得的多酚含量計算出標準偏差，為4.33%，說明該方法重復性良好，獲得的數(shù)據(jù)可靠。

3.3 加標回收率試驗

準確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，分別加入質(zhì)量濃度為1，2和3 μg/mL的沒食子酸標品，按照響應面分析獲得的最佳工藝條件進行試驗，每一個沒食子酸標品的濃度均進行3次平行試驗，獲得的加標回收率的平均值分別為98.6%，100.2%和100.5%，平均加標回收率為99.7%，這進一步證明了該工藝條件的穩(wěn)定。

4 結(jié)論與討論

參照響應面分析得到的結(jié)果，將測定條件在實際操作中略作調(diào)整，獲得的最佳工藝條件為福林酚試劑濃度 0.8 mol/L、20%碳酸鈉濃度的用量為0.6 mL、反應溫度40℃。在此條件下測得的冬棗總酚平均值為501±3.58 μg/mL，與預估值509.498 μg/mL的吻合度高達98.4%。所得冬棗總酚的測定結(jié)果穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

由于福林酚法也是測定蛋白質(zhì)的方法[18-19]，冬棗中的蛋白質(zhì)會干擾試驗結(jié)果，但是潘瑩[20]證明冬棗中的蛋白質(zhì)含量極少，這種干擾不會對試驗結(jié)果造成太大影響。由于所用碳酸鈉溶液中溶質(zhì)的溶解度隨溫度變化較明顯[21]，所以該方法在使用時建議在溫度適宜且恒定的條件下使用。