響應(yīng)面法優(yōu)化福林酚法測(cè)定冬棗中總酚含量

林倩，吳昊，劉芊辰，邵娟娟*

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院（滄州 061100）；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝院（保定 071000）

冬棗是一種屬于鼠李科的樹木果實(shí)，是一種兼具生態(tài)功能和經(jīng)濟(jì)功能的品種[1]，與其他品種的棗在成分組成、外型等方面有較大區(qū)別。冬棗中富含多酚[2]。多酚是植物的重要組分，有助于顏色、香氣的形成，同時(shí)也起到保護(hù)植物的作用[3]。多酚類化合物種類繁多，主要有黃酮、異黃酮、黃酮醇、兒茶素和酚酸的衍生物或異構(gòu)體，不同的結(jié)構(gòu)使多酚類化合物具有多種生物學(xué)特性，如抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、保護(hù)心血管等功能，被認(rèn)為是一種有效的健康保護(hù)劑以及食品天然防腐劑[4]。因此檢測(cè)冬棗中這些生物活性化合物具有很大的意義。

目前，檢測(cè)多酚類化合物的方法主要有高效液相色譜法和福林酚法等。其中福林酚法更適合食品組分較為簡(jiǎn)單的多酚的測(cè)定[5]，該方法同時(shí)具有靈敏度高、快速和可重復(fù)性良好等特點(diǎn)[6]，更加適合冬棗中多酚含量的測(cè)定。另外，多酚結(jié)構(gòu)的多樣性使得不同物質(zhì)中總酚的組成不相同，被檢測(cè)物質(zhì)中組成成分會(huì)影響測(cè)定結(jié)果[7]，并且組分含量及構(gòu)成對(duì)顯色反應(yīng)結(jié)果的影響也有差別[8]。由于目前針對(duì)冬棗中多酚含量測(cè)定的研究主要針對(duì)多酚提取體系等方面，應(yīng)用福林酚法測(cè)定冬棗中的總酚含量還未有所用試劑的定量標(biāo)準(zhǔn)[9]，影響了冬棗的開發(fā)利用，因此優(yōu)化福林酚法測(cè)定冬棗中總酚含量的工藝條件是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗：滄州市市售，無機(jī)械損傷，顆粒大小適中，成熟度均勻；沒食子酸標(biāo)品（分析純）、福林酚試劑（生化試劑）：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；烘箱、電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（珀金埃爾默儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考張萍等[10]的方法。準(zhǔn)確稱取10 mg沒食子酸標(biāo)品，加水定容至100 mL，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別移取0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5和1.75 mL于25 mL容量瓶中，加入10 mL超純水搖勻，分別加入0.65 mL的福林試劑，避光反應(yīng)后加入4 mL 20%碳酸鈉溶液，用超純水定容，于60℃水浴加熱10 min，冷卻后得到質(zhì)量濃度為0，1，2，3，4，5，6和7 μg/mL的沒食子酸系列溶液。將3 μg/mL的沒食子酸溶液在全波長(zhǎng)下掃描，并設(shè)置空白對(duì)照，確定最大吸收波長(zhǎng)，為720 nm。

在720 nm波長(zhǎng)下對(duì)系列溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定，以沒食子酸濃度（μg/mL）作為X軸，吸光度作為Y軸，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得方程為Y=0.096 8X-0.017 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 冬棗多酚的提取

將新鮮冬棗人工去核后切片，參考杜丹丹等[11]的方法，將冬棗在烘箱內(nèi)以40℃的溫度恒溫鼓風(fēng)干燥48 h，經(jīng)過加熱烘干以后，冬棗干中的多酚含量會(huì)有明顯上升[12-13]。用粉碎機(jī)將冬棗干粉碎為冬棗粉，然后置于不透明自封袋中低溫保存。準(zhǔn)確稱取10 g冬棗粉末于錐形瓶中，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，用保鮮膜封口，并將膜扎出若干小孔，放置于超聲波清洗機(jī)中，在60℃條件下提取1.5 h，經(jīng)過濾后的濾液以3 500 r/min離心20 min，獲得冬棗多酚溶液。準(zhǔn)確吸取1.5 mL冬棗多酚溶液于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線并搖勻。

1.3.3 冬棗多酚的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 福林酚試劑濃度的確定

此方法通過還原福林酚試劑來形成藍(lán)色復(fù)合物[14]，因此選擇福林酚試劑濃度作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，分別加入1 mL 0.2，0.4，0.6，0.8和1 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的碳酸鈉溶液，搖勻至于40℃的恒溫水浴鍋中，避光反應(yīng)1 h，在720 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，得到最佳福林酚試劑的用量，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。

1.3.3.2 碳酸鈉用量的確定

顯色反應(yīng)在碳酸鈉介質(zhì)中進(jìn)行，碳酸鈉的加入量會(huì)影響該方法，因此選擇碳酸鈉用量作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，加入1 mL 0.6 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入分別加入0.5，1，1.5，2和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的碳酸鈉溶液，搖勻至于40℃的恒溫水浴鍋中，避光反應(yīng)1 h，在720 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，得到最佳的碳酸鈉用量，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。

1.3.3.3 反應(yīng)溫度的確定

溫度會(huì)影響有色物質(zhì)的穩(wěn)定性以及碳酸鈉的溶解度，因此選擇溫度作為考察因素。取5份1 mL冬棗多酚溶液，加入1 mL 0.6 mol/L的福林試劑，混合均勻后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，搖勻后分別至于20，30，40，50和60℃的恒溫水浴鍋中，避光反應(yīng)1 h，在720 nm處進(jìn)行吸光度的測(cè)定，得到最佳反應(yīng)溫度，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。

1.3.4 冬棗多酚測(cè)定方法響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素的基礎(chǔ)上，選取福林酚試劑濃度、碳酸鈉用量、反應(yīng)溫度3個(gè)因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析過程中采用Origin 8軟件和Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與繪圖，采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 福林酚試劑濃度的影響

如圖2所示，福林酚試劑濃度對(duì)冬棗總酚測(cè)定結(jié)果的影響較大，隨著福林試劑濃度的上升，反應(yīng)物的含量上升，染色反應(yīng)進(jìn)行得愈加充分，從而使得靈敏度上升，因此所測(cè)得的總酚含量是逐步增加的。在福林酚濃度逐漸增大的過程中，多酚與福林酚的反應(yīng)趨于飽和，福林酚試劑濃度繼續(xù)增大，吸光度趨于平穩(wěn)。當(dāng)濃度為1 mol/L時(shí)所測(cè)得吸光度最大，且隨著福林試劑濃度的上升，所測(cè)得的吸光度上升幅度降低，考慮到經(jīng)濟(jì)因素、靈敏度、線性范圍，試驗(yàn)選擇0.8 mol/mL為最佳用量。

2.1.2 碳酸鈉用量的影響

如圖3所示，隨著碳酸鈉用量的增加，所測(cè)得的吸光度先上升后下降，且當(dāng)碳酸鈉用量為1 mL時(shí)，測(cè)得的吸光度最高，當(dāng)碳酸鈉的添加量大于1 mL以后，下降的趨勢(shì)會(huì)逐漸減小，且反應(yīng)后的溶液中有白色沉淀的析出。因此將碳酸鈉的最佳用量確定為1 mL。

圖2 福林酚試劑濃度對(duì)吸光度的影響

圖3 碳酸鈉用量對(duì)吸光度的影響

2.1.3 反應(yīng)溫度的影響

如圖4所示，隨著反應(yīng)溫度的上升，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度的上升為反應(yīng)創(chuàng)造最佳的條件，這種急劇下降的趨勢(shì)可能是50℃以上的高溫會(huì)破壞生成的有色物質(zhì)[15]，造成吸光度下降。所以初步確定最佳反應(yīng)溫度為50℃。

圖4 溫度對(duì)吸光度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)選取的3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到總酚含量對(duì)福林酚試劑濃度（A）、碳酸鈉用量（B）、顯色溫度（C）的回歸模型方程：總酚含量（Y，μg/mL）=-71.948 75+ 83.920 00A+15.587 75B+2.034 91C-10.355 00AB-0.141 25AC-0.071 950BC-44.459 37A2-3.412 50B2-0.022 861C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)選取的三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3所示。根據(jù)表3模型分析可知，二次回歸模型的F=48.36，p＜ 0.000 1，表明該模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項(xiàng)p=0.870 9，p＞0.05，說明失擬項(xiàng)差異不顯著，能充分反映實(shí)際情況，回歸模型是適合的；試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.941 6，說明冬棗多酚測(cè)定條件結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果有著良好的一致性，試驗(yàn)誤差較小，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj=0.963 8，這也驗(yàn)證了該模型的可靠。回歸方程各項(xiàng)方差分析中F值檢驗(yàn)可以判斷自變量對(duì)因變量的影響，由此可知該試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的各因素對(duì)冬棗中多酚檢測(cè)影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即20%碳酸鈉的用量對(duì)冬棗中總酚測(cè)定的影響最大，其次是福林酚試劑的濃度，對(duì)其影響最小的是處理溫度。通過對(duì)回歸方程與方差分析還可以了解到模型一次項(xiàng)中碳酸鈉的用量對(duì)冬棗中總酚的測(cè)定結(jié)果影響極顯著，福林酚試劑的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響顯著，而反應(yīng)溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，交互項(xiàng)中AB對(duì)結(jié)果的影響極顯著，AC、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著，二次項(xiàng)中A2與C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，B2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面中交互作用及優(yōu)化

多元二次回歸模型所作的響應(yīng)面圖是通過Box- Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的，響應(yīng)面圖形反映的是各個(gè)因素之間的相互關(guān)系以及相互作用程度[16]。固定其他因素，考察交互項(xiàng)對(duì)冬棗中多酚測(cè)定的影響，響應(yīng)面分析圖可用于評(píng)價(jià)該試驗(yàn)中設(shè)置的試驗(yàn)因素對(duì)冬棗總酚測(cè)定影響的兩兩交互作用[17]。各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響如圖5～圖7所示。響應(yīng)面坡度越陡峭，說明改變?cè)囼?yàn)條件對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，該因素對(duì)冬棗中總酚測(cè)定的影響越大；反之則表明該因素對(duì)冬棗中總酚測(cè)定的影響越不顯著。在交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響中，福林酚試劑濃度與碳酸鈉用量的交互作用顯著，其他因素之間交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 福林酚試劑濃度與碳酸鈉用量交互作用對(duì)總酚測(cè)定的影響

圖6 福林酚試劑濃度與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)總酚測(cè)定的影響

圖7 碳酸鈉用量與反應(yīng)溫度交互作用對(duì)總酚測(cè)定的影響

2.2.3 最優(yōu)測(cè)定條件確定

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到的最佳測(cè)定條件：福林酚試劑濃度為0.81 mol/L、20%碳酸鈉溶液用量為0.63 mL、反應(yīng)溫度為40.03℃。得到的預(yù)估總酚測(cè)定值為509.498 μg/mL。參照最佳工藝條件，且將測(cè)定條件在實(shí)際操作中略作調(diào)整：福林酚試劑濃度為 0.8 mol/L、20%碳酸鈉濃度的用量為0.6 mL、反應(yīng)溫度設(shè)為40℃，并進(jìn)行平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所測(cè)得的平均值為501±3.58 μg/mL，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果低于表2中的最高值，但是與最佳條件下的總酚含量測(cè)定的預(yù)估值相近，且吻合度高達(dá)98.4%，這驗(yàn)證了該測(cè)定條件的可靠性。

3 方法學(xué)考察

3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，加入0.8 mol/L福林酚試劑，30 s后加入0.6 mL 20%碳酸鈉濃度，置于40℃ 水浴鍋中反應(yīng)1 h，取出后分別放置0，1，2，3和4 h，再進(jìn)行吸光度的測(cè)試，所測(cè)得的吸光度分別為0.485，0.482，0.480，0.479和0.479。吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但下降的程度不大，在2 h以后趨于穩(wěn)定。這驗(yàn)證了該方法的穩(wěn)定性。

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，加入0.8 mol/L福林酚試劑，30 s后加入0.6 mL濃度為20%的碳酸鈉，置于40℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，并進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，所測(cè)得的冬棗多酚含量分別為501，497.42，504.35，495.60，492.94和502.20 μg/mL，根據(jù)上述測(cè)得的多酚含量計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，為4.33%，說明該方法重復(fù)性良好，獲得的數(shù)據(jù)可靠。

3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL冬棗多酚提取溶液，分別加入質(zhì)量濃度為1，2和3 μg/mL的沒食子酸標(biāo)品，按照響應(yīng)面分析獲得的最佳工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，每一個(gè)沒食子酸標(biāo)品的濃度均進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，獲得的加標(biāo)回收率的平均值分別為98.6%，100.2%和100.5%，平均加標(biāo)回收率為99.7%，這進(jìn)一步證明了該工藝條件的穩(wěn)定。

4 結(jié)論與討論

參照響應(yīng)面分析得到的結(jié)果，將測(cè)定條件在實(shí)際操作中略作調(diào)整，獲得的最佳工藝條件為福林酚試劑濃度 0.8 mol/L、20%碳酸鈉濃度的用量為0.6 mL、反應(yīng)溫度40℃。在此條件下測(cè)得的冬棗總酚平均值為501±3.58 μg/mL，與預(yù)估值509.498 μg/mL的吻合度高達(dá)98.4%。所得冬棗總酚的測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

由于福林酚法也是測(cè)定蛋白質(zhì)的方法[18-19]，冬棗中的蛋白質(zhì)會(huì)干擾試驗(yàn)結(jié)果，但是潘瑩[20]證明冬棗中的蛋白質(zhì)含量極少，這種干擾不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成太大影響。由于所用碳酸鈉溶液中溶質(zhì)的溶解度隨溫度變化較明顯[21]，所以該方法在使用時(shí)建議在溫度適宜且恒定的條件下使用。