丁香浸提液對亞硝酸鹽清除作用

殷坤鈺，謝微*

賀州學院食品科學與工程技術研究院（賀州 542899）

亞硝酸鹽是一種性狀與食鹽非常相似的無機含氮鹽，俗稱工業用鹽。亞硝酸鹽普遍分布在食物，像甜菜、白菜、菠菜、芹菜及蘿卜等綠色蔬菜中，亞硝酸鹽含量極高[1]，甚至有研究表明，人類攝入亞硝酸鹽有80%以上源于蔬菜[2]。亞硝酸鹽在人類生活中廣為使用，如在建筑業中用作防銹劑；在工業中用作絲綢和麻布的漂白劑；在食品工業中用作食品添加劑[3]。亞硝酸鹽給工業、建筑業和食品工業帶來巨大經濟價值。但同時也給人類健康帶來危害，它不僅能使人中毒，還具有嚴重致癌性。生活中一般食品都有硝酸鹽，在微生物亞硝基化菌的作用下還原形成亞硝酸鹽。據研究表明[4-5]，亞硝酸鹽屬于強氧化物，長期攝入的亞硝酸鹽進入血液后會把血色素中的二價鐵氧化成三價鐵，產生大量高鐵血紅蛋白，從而使血液載氧能力下降，進一步導致高鐵血紅蛋白癥。同時，可造成血管和血壓下降，導致外周血液循環障礙。亞硝胺含量達到一定量時，可在人體內誘發一系列疾病，如胃癌、直腸癌、食管癌和肝癌等[6]。亞硝酸鹽與胺類化合物不但在試驗室和自然條件下能合成亞硝胺，而且在人體和動物體內也能合成亞硝酸胺，但在人和動物的胃中更適合合成亞硝胺[7]。

丁香（Clove）是一種干燥花蕾，屬于桃金娘科被子植物，有雄丁香、丁子香、支解香、雞舌香等4個別稱，是中國重點開發研究的藥材之一，也是受人熟知但日常食用率極少的一種香辛料之一，是一種藥食兩用植物。研究發現，丁香具有抗氧化、抑菌防腐、溫中降逆、行氣止痛、溫腎等藥理作用[8]。此外，在國家公布的87種藥食兩用的原料中，丁香的抗氧化能力最強并位列首位，其中抗氧化活性的主要成分為多酚和黃酮化合物[9]。據郭艷華[10]研究表明，丁香總多酚含量與其總抗氧化能力、清除超氧陰離子和抑制脂質過氧化能力之間有顯著相關性。

近些年來，以香辛料為亞硝酸鹽清除劑的試驗研究增多。調查發現，研究趨勢從抗壞血酸（VC）轉移到富含VC、類黃酮和多酚類、有機硫化物等還原性物質的天然植物[11]。其中，有洋蔥[12]、大蔥[13]、山藥[14]、綠茶[15]、香辛料等富含VC、VE、茶多酚和有機硫化物的天然植物，它們具有清除亞硝酸鹽和阻斷

亞硝胺合成能力，達到防癌目的。香辛料的種類繁多，其中對亞硝酸鹽清除試驗的香辛料出現最多的是大蒜[16]、花椒[16]、生姜[17]、辣椒[18]等，也有以丁香為亞硝酸鹽清除劑的試驗研究，但均混合其他香辛料。同時，香辛料對亞硝酸鹽清除試驗中大多探討將提取液與亞硝酸鹽直接反應測定亞硝酸鹽清除率的影響因素。此外，也有側重于探討原料提取工藝的研究，但單獨以丁香為亞硝酸鹽清除劑的試驗尚未發現。因此，試驗以丁香為原料、超純水為溶劑，采用水浴提取法提取丁香有效物質，研究最佳提取工藝，并將提取的丁香浸提液用于消除亞硝酸鹽的研究，以期為進一步開發利用丁香或天然有效的亞硝酸鹽清除劑提供參考理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香（山東公丁香，產自山東棗莊，用組織粉碎機粉碎備用）。

冰醋酸（成陽市科龍化工試劑廠）；對氨基苯磺酸（廣州化學試劑廠）；鹽酸（西隴科學股份有限公司）；亞硝酸鈉（天津市科密歐化學試劑有限公司）；鹽酸萘乙二胺（天津市大茂化學試劑廠）；試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

Evolution 300紫外可見光分光光度計（賽默飛世爾科技有限公司）；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司））；DK-98-ⅡA單列四孔電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；FA2004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑的配制方法

對氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：將稱取的2 g對氨基苯磺酸和少量20%的鹽酸溶液充分攪拌溶解，用20%鹽酸溶液定容至500 mL，避光保存。

亞硝酸鹽標準溶液（25 μg/mL）：準確稱取0.5 g亞硝酸鈉固體，溶解后定容于100 mL容量瓶中（作為儲備液），采用逐級稀釋法稀釋溶液至25 μg/mL。

鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：準確稱取1 g鹽酸萘乙二胺，溶解后定容至500 mL，避光保存。

1.3.2 丁香浸提液的制備

依照文獻[19]方法提取并略作修改：稱取10 g粉末狀的丁香和150 mL蒸餾水在250 mL錐形瓶中攪拌均勻，置于45℃恒溫水浴鍋下水浴3 h，用循環水真空泵過濾、靜置，所得濾液備用。

1.3.3 標準曲線的繪制方法

從亞硝酸鹽儲備液中分別吸取幾個不同體積梯度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0和3.0 mL）于100 mL容量瓶中，定容，制成不同濃度亞硝酸鹽標準溶液。分別吸取2 mL置于50 mL容量瓶中，加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻，靜置4 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容至刻度。靜置15 min，于波長538 nm處測定吸光度。以縱坐標為吸光度，橫坐標為溶液濃度繪制標準曲線。

1.3.4 亞硝酸鹽清除率的測定方法

取25 μg/mL NaNO2溶液2 mL和15 mL丁香浸提液依次加入50 mL容量瓶中，混勻。加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻，靜置4 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水定容至刻度。靜置15 min，于波長538 nm處測定吸光度。嚴格按照上述步驟重復3次，并按式（1）計算丁香中亞硝酸鹽清除率。

式中：A1為未加丁香浸提液的吸光度；A2為加丁香浸提液的吸光度。

1.4 丁香浸提液最佳工藝條件的優化試驗

1.4.1 單因素試驗的測定方法

1.4.1.1 浸提時間的測定方法

把6個250 mL錐形瓶中分別加入10 g丁香粉末樣品和150 mL蒸餾水，混勻，做好標簽。置于45℃恒溫水浴鍋中分別浸提0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和4.0 h后過濾，取上層濾液，分別測定其亞硝酸鹽的吸光度并計算其清除率。

1.4.1.2 料液比的測定方法

取6個250 mL錐形瓶分別加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 g丁香粉末狀樣品和150 mL蒸餾水，混勻，做好標簽。分別置于45℃恒溫水浴鍋中浸提一定時間后過濾，取上層濾液，分別測定其亞硝酸鹽的吸光度并計算其清除率。

1.4.1.3 浸提溫度的測定方法

取6個250 mL錐形瓶按一定的料液比加入，混勻，做好標簽。置于30，35，40，45，50和55℃恒溫水浴鍋中分別浸提1.5 h后過濾取上層濾液，分別測定其亞硝酸鹽的吸光度并計算其清除率。

1.4.2 正交試驗方法

通過試驗結果可知，丁香浸提液提取的條件對亞硝酸鹽清除率的影響有浸提溫度、料液比、浸提時間等3個因素，現以這3個因素中選取適當的水平進行L9(33)正交，因素水平設計見表1所示，以丁香浸提液的制備條件進行優化試驗。

表1 丁香浸提液的制備條件正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽清除率的測定結果

根據表2的數據，由式（1）計算亞硝酸鹽清除率最終結果為20.300%。

表2 亞硝酸鹽清除率的測定結果

2.2 亞硝酸鹽標準曲線

亞硝酸鹽的標準曲線如圖1所示。

由圖1的標準曲線可知，亞硝酸鹽標準溶液的回歸方程為A=0.017 7C+0.073 1，相關系數R2=0.997 3，線性較好。

圖1 亞硝酸鹽的標準曲線

2.3 丁香浸提液制備工藝的單因素試驗結果

2.3.1 浸提時間對亞硝酸鹽清除率的影響測定

在設定料液比1∶15（g/mL），浸提溫度45℃反應條件下，不同浸提時間提取的丁香浸提液對亞硝酸鹽清除作用的效果見圖2。

結果表明，在設定好的料液比1∶15（g/mL）、浸提溫度45℃條件下，浸提時間在0.1～1.5 h，丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率隨著時間延長而逐漸增加，說明在此時間段，丁香浸提液的有效成分提取的效果越來越好。浸提時間增加至1.5 h時，其清除率達到83.08%且為整個反應體系中最高。浸提時間超過1.5 h時，亞硝酸鹽清除率不再呈現增加趨勢。可能的原因是在一定范圍內，浸提時間延長可使丁香有效成分不斷從丁香中釋放，但浸提時間延長到一定時間后，有效成分的擴散速度逐漸減慢或已基本溶出，隨著浸提時間繼續增加，丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率反而降低。因此，選擇浸提時間1.5 h為宜。

2.3.2 料液比對亞硝酸鹽清除率的影響測定結果

在設定浸提時間1.5 h，浸提溫度45℃反應條件下，不同料液比提取的丁香浸提液對亞硝酸鹽清除作用的效果見圖3。

料液比1∶150～1∶42（g/mL）時，圖3中呈現先升后降趨勢。料液比1∶150～1∶100（g/mL）時，亞硝酸鹽清除率在兩者之間有少量下降，但總體上來說差別不大，波動現象不太明顯。料液比增加到1∶75（g/mL）時，其清除率呈現上升狀態并達到最高值。料液比1∶60～1∶42（g/mL）時，清除率出現下降趨勢。說明過多的丁香添加量不僅沒有提高丁香浸提液清除亞硝酸鹽的效果，反而還會降低亞硝酸鹽清除率。因此，選擇料液比1∶75（g/mL）為最佳。

圖2 丁香浸提時間對亞硝酸鹽清除率的影響

圖3 丁香料液比對亞硝酸鹽清除率的影響

2.3.3 浸提溫度對亞硝酸鹽清除率的影響測定結果

在設定料液比1∶100（g/mL），浸提時間1.5 h反應條件下，不同浸提溫度提取的丁香浸提液對亞硝酸鹽清除作用的效果見圖4。

結果表明，在已設定前提條件的反應體系中，隨著浸提溫度延長，丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率呈現二降一升的變化趨勢。浸提溫度30～40℃時，丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率隨著溫度升高而出現逐漸下降狀態。浸提溫度40～50℃時出現緩慢上升。浸提溫度大于50℃時清除率又會出現下降趨勢，原因是一些具抗氧化性質的物質不穩定，溫度升高時導致丁香中一些抗氧化成分遭到破壞。因此，選擇浸提溫度50℃為宜。

2.4 丁香浸提液提取的正交試驗結果

丁香浸提液的最佳提取工藝的正交試驗結果及方差分析結果見表3和表4。

極差值的大小反映了各因素對丁香浸提液提取效果的影響，極差值大，該因素對丁香浸提液提取效果的影響力越大，反之越小。由表3中R所示，A的極差值最大，其次是B和C。有表4方差分析結果可知，丁香浸提液制備的3個影響因素對亞硝酸鹽清除率均沒有達到顯著水平。

圖4 丁香提取溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

表3 丁香浸提液最佳提取工藝優化的正交試驗設計與結果

表4 丁香浸提液提取正交試驗方差分析

在最佳提取工藝條件A3B1C3，該優化工藝條件與正交試驗里的試驗號7一樣。在經正交驗證可得，此最優條件下提取的丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率分別為88.69%，88.69%和88.89%，平均的亞硝酸鹽清除率為89.10%。

3 結論

丁香的生理活性作用有很多，但主要的還是防腐抑菌，抗氧化等。丁香屬于香辛料的一種，在食品加工過程中，不僅能起到調味作用，同時通過試驗確定丁香能夠消除亞硝酸鹽含量和阻斷亞硝胺合成。試驗中，不同條件如浸提時間、料液比、浸提溫度等提取的丁香浸提液，均會影響到其清除亞硝酸鹽能力。采用水浴提取法提取丁香有效物質，以單因素試驗和正交試驗，得到最佳提取工藝：浸提溫度55℃、料液比1∶100（g/mL）、浸提時間1.5 h。在此條件下進行最優驗證，可知提取的丁香浸提液對亞硝酸鹽清除率可達89.10%。