UPLC-MS/MS法測定食品中的4種木酚素

肖偉敏，王奇，董珊，蘇佳婷，彭祖茂，張協光?

深圳市計量質量檢測研究院，國家營養食品質量監督檢驗中心（廣東）（深圳 518109）

木酚素是一類有苯丙素氧化聚合而成的天然化合物，屬于植物雌激素，與人體雌激素十分相似，具有弱激素和抗雌激素雙向調節功能，以及非常高的抗氧化活性，在抗癌、保護心血管、治療糖尿病等方面有良好效果[1-6]。已報道的木酚素物質主要有亞麻木酚素（SDG）、開環異落葉松脂醇、落葉松脂醇、馬臺樹脂醇、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚等，其中SDG、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚的含量較高，亞麻籽中SDG的含量可達0.5%～1%；芝麻中芝麻素和芝麻林素的含量為0.5%～1%；谷物、蔬菜、水果等食品的木酚素含量較低[7]。含木酚素食品的日常攝入對人類慢性病有潛在的有益作用[8]，因此針對食品中有生物活性的木酚素類營養成分，建立相關物質的檢測方法對于建立食品營養成分數據庫、進行營養膳食補充指導以及開發木酚素營養保健食品均具有重要意義。

隨著木酚素類物質在營養食品、保健食品等領域的開發應用，相關營養保健食品在英國、美國等均已面市多年；一些復合營養食品如枸杞山藥芝麻粉、植物益生元八珍粉等，均含有亞麻木酚素和芝麻木酚素類物質，但目前國內還缺乏該類產品的質量技術支持。已報道的木酚素檢測方法和標準[9-10]主要是紫外分光光度法[11]、高效液相色譜法（HPLC）分別檢測SDG和芝麻木酚素[12-13]，樣品適用于亞麻籽、芝麻及其制品。紫外分光光度法測定干擾大，定量不準確；HPLC靈敏度達不到木酚素含量較低食品的定量水平；已報道的UPLC-MS/MS法未同時測定芝麻木酚素[14-15]。

鑒于尚未有同時檢測食品中主要木酚素物質（SDG、芝麻素、芝麻林素、芝麻酚）的標準和文獻報道，以及質量監管和質量技術支持的需求，試驗首次建立UPLC-MS/MS同時檢測食品中亞麻木酚素、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的方法。該方法適用范圍廣，準確簡便，可為后期木酚素的科學研究提供有效的數據查詢，為居民營養膳食提供科學指導，并能促進相關基礎應用和臨床應用的研究發展，更為后期國家標準的建立和市場產品監督提供足夠的技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000）；三重四級桿質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific TSQ Quautis）；分析天平（Sartorius，感量0.1 mg）。

亞麻木酚素、芝麻素、芝麻林素標準品（購自安譜，純度≥98.8%）；芝麻酚標準品（購自CATO，純度99.9%）；4種木酚素的化學信息見表1。氫氧化鈉和無水乙醇為分析純，甲醇和甲酸為色譜純；芝麻香油（自制）；其余樣品市售。

1.2 試劑配制

70%乙醇：量取70 mL無水乙醇加水稀釋至100 mL，混勻。

70%乙醇-1 mol/L氫氧化鈉溶液：稱取20 g氫氧化鈉，用適量水溶解，冷卻后定容至150 mL，與350 mL無水乙醇于燒杯中混勻。

鹽酸溶液（10.6 mol/L）：量取88 mL鹽酸加水稀釋至100 mL，混勻。

表1 4種木酚素的化學信息

1.3 標準溶液的配制

用甲醇配制質量濃度均為1.00 mg/mL的亞麻木酚素、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素標準儲備液，于4℃保存。然后稀釋配制4種木酚素質量濃度為0.040 0，0.100，0.400，1.00，2.00和10.0 μg/mL系列標準工作液。

1.4 分析條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）。流動相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，70%～40% A；3～5 min，40%～20% A；5～9 min，20%～2% A；9～12.5 min，2% A；12.5～12.6 min，70% A；12.6～15 min，70% A。流速0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣體積2 μL。

1.4.2 質譜條件

采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；選擇反應監測（SRM）掃描；離子源電壓3 500 V；蒸發溫度360℃；離子傳輸管溫度300℃；鞘氣（N2）42 bar，輔助氣（N2）10 bar，吹掃氣0 bar。4種木酚素質譜參數見表2。

表2 4種木酚素的UPLC-MS/MS分析參數

1.5 樣品前處理

1.5.1 試樣制備

液體或固體粉末樣品：將樣品混合均勻后，立即測定或于冰箱中冷藏。

新鮮水果和蔬菜類：取500 g左右樣品，用勻漿機或者粉碎機將樣品均質，制得均勻性一致的勻漿，立即測定或者于冰箱中冷凍保存。

其他含水量較低的固體樣品：如含水量在15%左右的谷物，取100 g左右樣品，用粉碎機將樣品粉碎，制得均勻性一致的粉末，立即測定或者于冰箱中冷藏保存。

1.5.2 試樣處理

稱取0.5～5 g混合均勻的固體試樣或0.3～0.5 g油樣于50 mL離心管中，加入40 mL 70%乙醇-1 mol/L NaOH水溶液，漩渦混勻；于65℃空氣控溫搖床上，以350 r/min振搖1 h。用10.6 mol/L鹽酸將pH調至4.0～4.5，用70%乙醇水溶液定容至50 mL，搖勻，離心；取清液，用0.45 μm微膜過濾，上機。若樣品中分析物的含量不在標準曲線范圍內，用70%乙醇水溶液稀釋后上機。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用蠕動泵進樣的方式，將1 μg/mL單標溶液以10 μL/min的流速連續注入ESI源中，在正離子模式下進行一級質譜全掃描，得到待測物的母離子峰。優化離子源氣流、電壓、溫度等參數，使母離子峰的響應強度優且穩定；對母離子峰進行二級質譜掃描，確定子離子，優化碰撞能量和RF lens。優化后的質譜參數見表2。

SDG分子中含有兩個葡萄糖苷單元，在ESI+模式下，產生的離子峰m/z709.17為[M+Na]+，響應弱；m/z327.04為[M+H-2Glu-2H2O]+，是SDG脫去2個葡萄糖殘基（葡萄糖殘基：162 Da）和2分子水的離子峰，響應較好；因此，選用m/z327.04作為SDG的母離子。m/z138.12為芝麻酚的離子峰[M+H]+。芝麻素、芝麻林素在ESI+模式下，易脫去1分子的水，形成[M+HH2O]+離子峰，分別為m/z337.04和m/z353.05。

2.2 液相色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗使用了Hypersll Gold（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）3種色譜柱。Hypersll Gold色譜柱分離4種木酚素時，SDG及芝麻酚的峰形拖尾；使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱時，各物質保留時間不穩定；而ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱在分離4種木酚素時有較好的色譜峰和穩定的保留時間。故選擇使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。

2.2.2 流動相條件的優化

試驗比較了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水的分離效果。結果發現，乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，SDG響應不穩定；而采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動相時，4種木酚素的響應均較穩定，峰形也好（圖1和圖2），推測SDG在甲醇-0.1%甲酸水體系下離子化效果較好。故采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動相。

圖1 4種木酚素混合標準溶液的超高效液相色譜-串聯質譜圖

圖2 植物益生元八珍粉中4種木酚素的超高效液相色譜-串聯質譜圖

2.3 提取條件的確定

SDG為水溶性的木酚素，在自然條件下以聚合物形式存在，只有在被堿水解后才能游離出SDG單體；有機堿甲氧基鈉和三乙胺、無機堿氫氧化鈉均可完成此水解過程。SDG在醇堿溶液中可以實現堿解與提取同時進行，更簡便高效，提取效果更好[15-16]。芝麻素、芝麻林素、芝麻酚為脂溶性的木酚素，甲醇和乙醇亦是常用提取溶劑[17]。因此，為實現同時提取食品中的4種木酚素，并綜合考慮安全性和經濟性，試驗選用常用的氫氧化鈉進行堿解，以及更經濟安全的乙醇浸提。

試驗分別考察了60%，70%和80%乙醇-NaOH（1 mol/L）溶液提取亞麻籽中SDG、白芝麻中的芝麻素、芝麻林素的情況（圖3）。結果表明，70%乙醇-NaOH（1 mol/L）水溶液在提取SDG、芝麻素、芝麻林素時有更好的提取率。

圖3 乙醇比例對提取率的影響（n=3）

由于樣品中SDG的提取和樣品中油脂的皂化均與堿濃度大小有關。因此，試驗分別用70%乙醇配制0.1，0.5，1，2和3 mol/L NaOH的提取液，考察不同堿濃度對木酚素提取的影響。亞麻籽、白芝麻中木酚素提取情況見圖4。結果表明，堿濃度對SDG的提取有較大影響，1 mol/L NaOH乙醇溶液提取率最高；堿濃度增大到3 mol/L，提取率無明顯變化；堿濃度對芝麻中油脂皂化有一定影響，堿濃度升到0.5 mol/L后，芝麻素、芝麻林素的提取率未有明顯變化。綜合考慮SDG的提取條件，確定70%乙醇-1 mol/L NaOH水溶液為最佳提取溶劑。醇堿溶液提取后的粗提液，經HCl調節pH至4～4.5，蛋白或肽類的雜質會沉淀下來，起到凈化作用。

圖4 NaOH濃度對提取率的影響（n=3）

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

將木酚素系列標準工作液按優化方法進樣，以標準系列溶液濃度為橫坐標（x），以相應的峰面積為縱坐標（y）做線性回歸方程；以信噪比（S/N）為3和10分別計算檢測限和定量限，結果見表3。4種木酚素的相關系數R在0.999 5～0.999 9之間，線性范圍在0.040 0～

10.0 μg/mL濃度范圍內，各物質的線性相關性較好。

2.5 回收率及精密度試驗

亞麻籽油中未檢出4種木酚素成分，故試驗采用亞麻籽油為空白樣品進行加標，分別添加低、中、高3個水平的混合標準工作液，每個添加水平做6個平行樣品，測定的回收率及精密度見表4。結果表明，4種木酚素的回收率范圍均在95.0%～101%之間，RSD在1.0%～3.1%之間，回收率和精密度符合GB/T 27404—2008 F.1和F.3的要求[18]。

表3 木酚素的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量限

表4 4種木酚素的加標回收率和相對標準偏差（n=6）

2.6 實際樣品分析

試驗分別檢測了亞麻籽、黑芝麻、白芝麻、芝麻油、枸杞山藥芝麻酚、草莓干、茶葉、植物益生元八珍粉、木酚素軟膠囊等多種類型的樣品，結果見表5。結果表明，亞麻籽中SDG含量較高，亞麻籽1的含量可達8.78×103mg/kg；而6種亞麻籽油均無SDG檢出，這是由于SDG是水溶性的化合物，不溶于油脂中；草莓干、山藥干、茶及木酚素軟膠囊保健食品中均有一定的SDG檢出；芝麻及其制品中含有較高的芝麻素和芝麻林素；自制芝麻油1中芝麻素含量為7.88×103mg/kg，芝麻林素含量為3.83×103mg/kg，市售芝麻油2中芝麻素含量為2.61×103mg/kg，芝麻林素未檢出，2種芝麻油中芝麻木酚素含量差異較大；枸杞山藥芝麻粉、植物益生元八珍粉等復合營養食品，4種木酚素成分均有一定量的檢出（見圖2）。購自美國的木酚素軟膠囊中檢出的亞麻木酚素為110 mg/kg，比蔬果類的亞麻木酚素含量高，但比亞麻籽中的木酚素含量低約80倍。

表5 食品中木酚素的含量 mg/kg

3 結論

試驗首次采用UPLC-MS/MS法同時分析食品中的4種主要木酚素物質，實現了蔬果制品、保健食品、茶葉等15個樣品中SDG、芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的定量分析。該方法為一步醇堿提取，簡便高效，靈敏度高，可準確檢測木酚素含量較低的食品，豐富了食品營養成分數據庫。通過分析自制芝麻油1和市售芝麻油2中的芝麻素和芝麻林素，可發現芝麻油產品中芝麻素和芝麻林素的含量差異明顯，芝麻木酚素可作為芝麻油的特征指標，為市場上芝麻油的摻偽摻假鑒別提供一定的技術支持。