梅州地區柑橘黃龍病的常規PCR與實時熒光定量PCR檢測技術研究與應用

李月 張志標 周玉蓉 鐘進良 馬瑞豐 劉蕊 黃城 陶星星

摘要? ? 本文利用TaqMan探針實時熒光定量PCR（qPCR）檢測技術對梅州地區疑似柑橘黃龍病樣品進行檢測，并與常規PCR檢測進行對比。結果表明，實時熒光定量PCR用于檢測柑橘黃龍病菌結果快速、準確、可靠且無污染。采用2種方法對梯度稀釋的陽性樣本進行檢測發現，實時熒光定量PCR的靈敏度較常規PCR更高，能夠檢出樣品中痕量的病原菌。本研究在梅州地區建立了以實時熒光定量PCR方法進行柑橘黃龍病疑似植株的檢測，可以為梅州地區提供更準確、更靈敏、快速的黃龍病檢測技術。

關鍵詞? ? 柑橘黃龍病;實時熒光定量PCR;靈敏度;廣東梅州

中圖分類號? ? S664.4? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）08-0103-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In this paper，TaqMan probe real-time quantitative PCR（qPCR）detection technology was used to detect suspected citrus huanglongb-ing samples in Meizhou area，and compared with conventional PCR detection.The results showed that real-time fluorescent quantitative PCR for detecting citrus huanglongbing was fast，accurate，reliable and free pollution.Two methods were used to detect the gradient-diluted positive samples，which showed that the sensitivity of real-time quantitative PCR was higher than that of conventional PCR，and it could detect trace amounts of pathogenic bacteria in the samples.This study established a real-time quantitative PCR method to detect suspected citrus Huanglongbing plants in Meizhou area，which could provide more accurate，sensitive and rapid Huanglongbing detection technology in Meizhou area.

Key words? ? citrus huanglongbing;real-time fluorescent quantitative PCR;sensitivity;Meizhou Guangdong

柑橘作為重要的經濟作物之一，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區，產量居于世界水果之首[1]。梅州市作為全國最大的柚類生產基地，生產區域覆蓋了所轄的梅江區、梅縣區、大埔縣、興寧市、五華縣等共65個鎮[2]。隨著種植面積的不斷擴大，其病蟲害問題也接踵而至，其中最為嚴重的是柑橘黃龍病（cirtus huanglongbing，HLB）。柑橘黃龍病病原菌隸屬于韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberobacter），分為亞洲種（Can-didatus Liberibacter asiaticus）、非洲種（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲種（Candidatus Liberibacter americanus）[3-4]，其傳播方式主要為柑橘木虱傳播、嫁接傳播和運輸傳播3種方式。

柑橘黃龍病在田間的癥狀表現復雜難辨，其典型癥狀為葉片斑駁黃化、紅鼻子果、新梢均勻黃化等。目前，國內外對柑橘黃龍病的檢測方法除了田間癥狀診斷外，還有嫁接診斷、生化和電鏡檢測、血清學檢測以及分子生物學檢測等[5]。分子生物學檢測方法因其準確度和靈敏度高、操作簡便、檢測快速等被廣泛用于柑橘黃龍病的診斷。常用的PCR檢測方法包括常規PCR、巢式PCR以及實時熒光定量PCR等3種方法。

本文利用TaqMan探針實時熒光定量PCR體系對梅州地區疑似柑橘黃龍病樣品進行檢測。TaqMan探針使用雜交探針，特異性高且可靠，由于實時熒光定量PCR的擴增片段小、靈敏度好、穩定性高、不易受外界污染、操作簡便等優勢，使實時熒光定量PCR比常規PCR更適用于檢測柑橘黃龍病疑似樣本。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

植物樣品主要來自梅州各個縣區的柑橘種植園，植株葉片出現原因不明的黃化現象。陰性對照為梅州市農業科學院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 植物總基因組DNA的提取。柑橘植株總基因組的提取方法參照天根生物公司高效植物基因組DNA提取試劑盒，并根據實際情況進行簡單修改。稱取0.1 g新鮮柑橘葉脈，用剪刀剪碎后放入2 mL離心管中，加入400 μL緩沖液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/μL），置于組織研磨機（MP Fast-Prep-24）中高速振蕩研磨25 s，后續提取程序參照基因組提取試劑盒說明書[6]。

取2 μL 提取的基因組DNA 在超微量分光光度計（Na-noDrop One）上檢測樣品濃度及純度，剩余樣品置于-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.2.2? ? 引物。利用柑橘黃龍病病原亞洲種的16S rDNA設計合成引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成，具體見表1、2。

1.2.3? ? 常規PCR。常規PCR的擴增體系為25 μL，其中DNA模板1.0 μL，引物 OI1和OI2c各1.0 μL，2xPCRmaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度60 ℃，72 ℃ 60 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min。空白對照為ddH2O，陰性對照為梅州市農業科學院柑橘無病毒苗木繁育基地健康植株提取的基因組DNA，陽性對照為帶病植株基因組DNA。PCR擴增完成后，取6.0 μL擴增產物，以5.0 μL DNA Marker（DL 2000，TAKARA）為標記進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間35 min。電泳結束后在凝膠成像系統下觀察結果，如在1 167 bp（OI1/OI2c為引物）處出現擴增條帶，則該樣品為陽性，該植株感染黃龍病。

1.2.4? ? 實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR的擴增體系為20 μL，其中DNA模板2.5 μL，引物HLB asf和HLB asr各0.5 μL，HLB Probe 0.25 μL，Master Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL。反應程序在實時熒光定量PCR儀（StepOnePlus）上進行，在95 ℃條件下預變性30 s，95 ℃ 10 s，60℃ 10 s，60 ℃ 20 s同步多次采集熒光，共40個循環。空白對照為ddH2O，陰性對照為梅州市農業科學院柑橘無病毒苗木繁育基地的健康植株提取的基因組DNA，陽性對照為帶病植株基因組DNA。檢測結果以反應管內熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數（即 CT值）顯示，CT值≤35表示該樣品為黃龍病陽性，CT值>35為陰性，CT值越低，則表明黃龍病菌含量越高。

1.2.5? ? 實時熒光定量PCR與常規PCR靈敏度對比。取同時通過1.2.3和1.2.4方法檢測確定為陽性的樣品，通過超微量分光光度計對其基因組DNA濃度進行檢測，確定樣品基因組DNA的濃度，并進行梯度稀釋，分別用常規PCR和實時熒光定量PCR對稀釋后的系列樣品進行檢測。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 柑橘總DNA的提取及含量檢測

以疑似感染黃龍病植株葉片的葉脈為材料提取基因組DNA，基因組DNA的A260/A280比值在1.6～1.9之間，提取效果較好，可用于后續PCR擴增。

2.2? ? 柑橘黃龍病常規PCR檢測與實時熒光定量PCR檢測結果

為了評價常規PCR方法與實時熒光定量PCR方法檢測結果的符合程度，用以上2種方法分別對梅州市各縣區采集的疑似黃龍病樣品共40個進行檢測，檢測結果見圖1、2及表3。

給常規PCR檢測發現，9個樣品在1 167 bp處擴增出特異性電泳條帶，陰性對照、空白對照在此位置無特異性擴增條帶;實時熒光定量PCR檢測發現，12個樣品的CT值≤35，即為黃龍病陽性，陰性對照、空白對照無CT值。對比檢測結果，只要實時熒光定量PCR檢測為陽性的樣品，常規PCR全為陽性，表明實時熒光定量PCR用于檢測柑橘黃龍病菌結果快速、準確、可靠且無污染，同時避免了使用有害物質。

2.3? ? 實時熒光定量PCR與常規PCR靈敏度對比

取同時通過常規PCR和實時熒光定量PCR方法檢測確定為陽性的樣品，通過超微量分光光度計確定樣品基因組 DNA濃度，并進行梯度稀釋，結果見表4。分別用常規PCR和實時熒光定量PCR對稀釋后的系列樣品進行檢測，結果如圖3所示。可以看出，在相同稀釋倍數下，常規PCR檢測為陰性的樣品實時熒光定量PCR檢測結果為陽性，表明實時熒光定量PCR的靈敏度較常規PCR更高，能夠檢出樣品中痕量的病原菌。

3? ? 結論與討論

本實驗室在梅州地區建立了柑橘黃龍病PCR快速檢測技術[6]，在檢測篩查過程中發現，同樣的植株，半年前檢測結果為陰性，在半年后的檢測中呈陽性，顯示常規PCR檢測技術對黃龍病感染初期的檢出率較低。因此，本研究建立了以實時熒光定量PCR方法進行柑橘黃龍病疑似植株的檢測，可以為梅州地區提供更準確、更靈敏、更快速的柑橘黃龍病檢測技術。

由于柑橘品種種類繁多，在田間情況下感染黃龍病的表現形式不一而同，不同病害、藥害、缺素等表現癥狀也給田間診斷黃龍病增加了難度，且黃龍病菌在植株體內含量分布不均勻，因而常導致誤診。而PCR技術的快速、靈敏、準確等優點使其成為當前檢測柑橘黃龍病的主要手段。常規PCR成本較低，多適用于大規模的田間初次普查檢測;實時熒光定量PCR適合對常規PCR沒有檢出的疑似樣品進行進一步的檢測確認，或對黃龍病菌侵染早期、含菌量較低的樣本，如種苗、接穗等進行檢測。

在實際應用中，可結合田間診斷，通過“紅鼻子果”以及葉片斑駁黃化這2個特征對柑橘黃龍病進行形態學鑒定[8]，并通過常規PCR以及實時熒光定量PCR檢測技術進行進一步確認。

4? ? 參考文獻

[1] 鄧秀新.世界柑橘品種改良的進展[J].園藝學報，2005，32（6）：1140-1146.

[2] 李月，張志標，鐘進良，等.梅州柚產業現狀及發展對策[J].現代農業科技，2019（3）：75-78.

[3] TEXEIRA D C，AYRES J，KITAJIMA E W，et al.First report of a huangl-ongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State，Braziland association of a new liberibacter species，"Candidatus Liberibacter americanus"，with the disease[J].Plant Disease，2005，6：89-107.

[4] 胡文召，周常勇.柑橘黃龍病病原研究進展[J].植物保護，2010，36（3）：30-33.

[5] 胡浩.應用熒光定量PCR技術研究亞洲韌皮部桿菌在寄主體內的動態變化及分布[D].重慶：重慶大學，2007.

[6] 張志標，李月，黃城，等.梅州地區柑橘黃龍病的PCR快速檢測[J].東南園藝，2018（5）：19-22.

[7] WENBIN LI，JOHN S，HARTUNG，LAURENE LEVY.Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associate with citrus huanglongbing[J].Journal of Microbiological Methods，2006（66）：104-115.

[8] 吳礽超，趙小龍，王明召.柑橘黃龍病檢測技術概述[J].廣西園藝，2007，18（6）：59-60.