葫蘆素D通過下調GATA6表達抑制SGC-7901胃癌細胞增殖遷移的作用機制研究

馮曉波， 李敏虹， 尚精娟， 周 穎

(上海市第七人民醫院胃腸疾病診療部， 上海 200136)

胃癌細胞的增殖和轉移是導致患者死亡的主要原因。雖然化療和手術方面已經取得了一些進展，由于大多數患者被診斷為晚期疾病階段，其預后中位數總體生存時間≤12個月[1]。因此，研究者致力于開發新的藥物和研究其機制，以提高胃癌的診療水平。胃癌的分子機制復雜，涉及遺傳因素與環境因素的相互作用。在這些機制中，GATA轉錄因子6(GATA6)可能是治療人類癌癥的新分子靶點。GATA6是GATA家族成員之一，表達于肺、胰腺、胃腸道等內胚層組織和心臟等中胚層組織，通過與組織內的(A/T)GATA(A/G)序列結合，調控組織中各種分化基因的表達[2]。除了分化，GATA6還與細胞增殖、細胞存活和各種細胞類型的腫瘤轉化有關[3]。研究表明，GATA6在包括胃癌在內的多種癌癥中過度表達；同時，GATA6的活性升高通過促進細胞增殖、細胞周期進程和細胞遷移而促進腫瘤的發生和發展[4]。葫蘆素是一類四環三萜類化合物，根據結構的不同分為葫蘆素A到T 17個亞型，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。其中葫蘆素B、D、E、I 具有顯著的抗瘤作用，可以抑制腫瘤細胞的生長。然而，葫蘆素D抗腫瘤的作用機制研究較少。本研究用不同濃度葫蘆素D干預SGC-7901胃癌細胞，觀察增殖和遷移情況，并檢測GATA6的水平，探討葫蘆素D治療胃癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器:SGC-7901胃癌細胞(批號：CK-0143，中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫)；葫蘆素D(批號：3877-86-9，純度≥98%，成都麥德生科技有限公司)；順鉑(純度99.99%，批號：P4394，美國sigma公司)；胎牛血清(批號：TBD21HY，美國Gibco公司)；RPMI-1640培養基、二甲基亞砜(DMSO)(批號：PM150210B、PM170319R，天津潤泰科技發展有限公司)；四噻唑藍(Methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(批號：M4016-5，美國Amresco公司)；細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(批號：CA1020、CA1047，美國BD公司)；Trizol ReagentRNA提取試劑盒(批號：DP325，美國Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、UltraSYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(批號：RR047A、TK08045，寶生物工程大連有限公司)；C170型二氧化碳細胞培養箱(德國Binder公司)；3-18K型高速低溫離心機(德國SIGMA公司)；奧林巴斯CX43型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)；7500Fast型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2細胞培養及實驗分組:用含胎牛血清(10%)的RPMI-1640培養液在37℃、5% CO2條件下培養SGC-7901細胞，選擇對數生長期細胞進行實驗。根據MTT法，以5×103/孔接種于96孔板中，200μL/孔，用不同濃度葫蘆素D(0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmoL/L)培養48h后加入MTT(50μL/孔)，繼續培養4h，離心棄上清，加入DMSO(200μ/孔)，振蕩，用酶標儀在450nm處檢定吸光度值(OD值)，計算細胞抑制率，細胞抑制率=(對照組OD值-處理組OD值)/對照組OD值×100%。根據半數抑制率確定葫蘆素D的干預劑量。實驗分為對照組、順鉑組、葫蘆素D低、中、高劑量組。對照組不進行處理，順鉑組給予終濃度為10.0μmoL/L的順鉑，葫蘆素D低、中、高劑量組分別給予終濃度為2.0、4.0、8.0μmoL/L的葫蘆素D，繼續培養48h后進行相關檢測。

1.3細胞劃痕法檢測SGC-7901細胞遷移能力:以5×104/孔接種于6孔板內，200μL/孔，待細胞貼壁后，用100μL滅菌槍頭在單層細胞上呈“-”字劃痕，用無血清的RPMI-1640培養基清洗3次，用不同劑量的葫蘆素D干預48h，用顯微鏡下拍照，3-5個視野/孔，用圖像分析儀測量劃痕寬度，實驗重復3次。

1.4實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miRNA-143和GATA6 mRNA表達:以5×104/孔接種于6孔板內，200μL/孔，待細胞貼壁后，用不同劑量的葫蘆素D干預48h，棄培養基，根據RNA提取試劑盒操作說明書進行總RNA提取，根據RNA反轉錄試劑盒說明合成cDNA，再根據熒光定量PCR試劑盒說明，制備20ul反應體系進行擴增，在CFX-96 PCR擴增儀中進行擴增。GATA6、微小RNA-143(miRNA-143)和U6引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，GATA6上游引物為5'-CACACGCTGACAGTGCTGG -3'，下游引物為5'-TACAGGGCGATACAAAGCAGGAGAA-3'；miRNA-143上游引物為5'-ACACTCGAGCTGGGGCTTCTCCTGGCTCTCC-3'，下游引物為5'-TGGTGTGGTGGAGTCG-3'；U6引物序列：上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物為：5- ACGCTTCACGAATTTGCGT -3'；反應條件為預變性95℃ 30s、變性 95℃ 5s、60℃ 44s、40個循環，61 ℃時采集熒光，用實時熒光定量 PCR儀檢測對其表達量進行結果分析，以U6作為內參，采用 2-△△Ct法計算miRNA-143和GATA6 mRNA的相對表達量。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期情況:以5×104/孔接種于6孔板內，200μL/孔，待細胞貼壁后，用不同劑量的葫蘆素D干預48h，棄培養基，消化后轉移至離心管內，離心棄上清，根據試劑盒說明書步驟，用流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期情況。

2 結 果

2.1不同濃度葫蘆素D對SGC-7901細胞生長的影響:隨著葫蘆素D劑量增加，SGC-7901細胞抑制率增加，與0μmoL/L比較，差異有統計學意義(P<0.05)。在葫蘆素劑量為8.0μmoL/L時，抑制率為53.07%，故選8.0μmoL/L作為最高干預劑量，并設2.0μmoL/L和4.0μmoL/L兩個劑量,見表1。

表1 不同濃度葫蘆素D對SGC-7901細胞生長的影響

注：與空白對照組比較，aP<0.05

2.2葫蘆素D對SGC-7901細胞遷移能力的影響:與對照組比較，順鉑組SGC-7901細胞遷移能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細胞遷移能力降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統計學意義(P<0.05),見表2、圖1。

表2 葫蘆素D對SGC-7901細胞遷移能力和ROS水平的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

2.3葫蘆素D對SGC-7901細胞中miRNA-143和GATA6 mRNA表達的影響:與對照組比較，順鉑組SGC-7901細胞中miRNA-143 mRNA的相對表達量增加，GATA6 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細胞中miRNA-143 mRNA的相對表達量增加，GATA6 mRNA相對表達量降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 葫蘆素D對SGC-7901細胞中miRNA-143和GATA6 mRNA表達的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

2.4葫蘆素D對SGC-7901細胞凋亡和細胞周期的影響:與對照組比較，順鉑組SGC-7901細胞凋亡率和S期細胞比例增加，G0/G1期細胞比例降低，差異有統計學意義(P<0.05)；給予葫蘆素D處理后，SGC-7901細胞凋亡率和S期細胞比例增加，G0/G1期細胞比例降低，呈劑量依賴性，但效果不如順鉑組，差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 葫蘆素D對SGC-7901細胞凋亡和細胞周期的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，bP<0.05；與葫蘆素D低劑量組比較，cP<0.05；與葫蘆素D中劑量組比較，dP<0.05

圖1 葫蘆素D對SGC-7901細胞遷移能力的影響

注A:對照組，B:順鉑組，C:葫蘆素D低劑量組，D:葫蘆素D中劑量組，E:葫蘆素D高劑量組

3 討 論

胃癌是導致癌癥相關死亡的第二大最常見原因，盡管研究者對胃癌做了很多研究，但尚無有效的治療方法。大多數侵襲性胃癌患者對手術和放療無效，但作為姑息性治療對全身化療敏感。因此，開發胃癌潛在的替代化療藥物是非常令人鼓舞的。順鉑是常用一線化療藥，但其毒副作用較多。據報道，葫蘆素D可以抑制不同癌細胞的增殖，包括乳腺癌細胞、細胞淋巴瘤細胞和肺鱗癌細胞[5]。本研究發現，葫蘆素D對SGC-7901細胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。

胃癌細胞的運動性在轉移過程中起著至關重要的作用。許多報道的研究已經證實了葫蘆素D對不同癌癥類型的遷移和侵襲的影響[6]。葫蘆素D的治療通過下調GATA6和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制肺癌遷移[7]。在另一項研究中，葫蘆素D通過體外抑制GATA6和Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A，RhoA)的表達，抑制基質金屬蛋白酶-2/9(Matrix metalloproteinase -2/9，MMP-2/9)的表達，抑制了人骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[8]。然而，葫蘆素D對胃癌SGC-7901細胞運動功能的影響尚未見報道。本研究結果顯示，葫蘆素D在體外降低了胃癌SGC-7901細胞遷移。因此，葫蘆素D有望成為抑制腫瘤進展和轉移的有效候選藥物。

GATA6參與細胞周期進展、細胞生長、分化、代謝和凋亡的調控[9]。研究發現，過表達GATA6增加了MKN28胃癌細胞系的細胞增殖；同時，通過對Wnt拮抗劑Dickkopf-1進行負調控，激活Wnt信號通路，發現過表達GATA6可促進胰腺癌細胞株AsPC-1和PANC-1的增殖[10]。已有研究表明，葫蘆素D對不同癌細胞的增殖抑制作用與G0/G1期、S期或G2/M期阻滯有關，而細胞阻滯在S期被認為是細胞凋亡的標志[11]。越來越多的文獻表明，miRNA-143在包括胃癌在內的多種人類癌癥中發揮抑癌作用，參與包括腫瘤發生和發展在內的許多生物學過程[12]。通過生物信息學分析顯示，miRNA-143與GATA6的3'UTR結合，表明GATA6是miRNA-143潛在是靶基因。在胃癌的發生發展過程中，miRNA-143調控了胃癌間質成纖維細胞中Ⅲ型膠原的表達，通過靶向GATA6抑制胃癌細胞自噬，促進胃癌細胞凋亡，增強了槲皮素的化學敏感性[13]。本研究顯示，葫蘆素D可以上調miRNA-143的表達，從而抑制GATA6的表達，抑制了SGC-7901細胞的增殖，將SGC-7901細胞阻滯在S期，誘導SGC-7901細胞凋亡，這更激發了我們對葫蘆素D潛在作用機制的探討。

綜上所述，葫蘆素D能抑制SGC-7901胃癌細胞增殖和遷移，引起細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡，具有一定的抗癌活性，其機制可能與葫蘆素D通過下調GATA6表達有關，為葫蘆素D治療胃癌提供理論依據。總之，葫蘆素D可能是一種有希望的抗癌藥物，能夠對抗胃癌的進展和轉移。