七葉皂苷鈉對小鼠變應性接觸性皮炎作用研究

王大貴 李 梅 李 竣 石召華 黃先菊*

1.中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074；2.武漢愛民制藥股份有限公司，湖北 武漢 436070

七葉樹又名婆羅樹、梭羅樹，屬落葉喬木，與懸鈴木、榆樹、椴樹并稱為世界四大優美行道樹。在我國種類較多，分布范圍廣。其中中華七葉樹(AesculuschinensisBge)、浙江七葉樹(A.chinensisBge.var.ChekiangensisFang)和天師栗(A.wilsoniiRehd)的干燥成熟種子稱“娑羅子”，是中國藥典收載的常用中藥。娑羅子的主要成分為皂苷類化合物，具有疏肝、理氣、和胃、止痛、殺蟲之功效[1]，還具有抗炎、消腫脹、抗滲、抗癌作用[2]，來臨床用于治療冠心病。七葉皂苷鈉主要成分為七葉皂苷鈉A、B、C、D，是從七葉樹科植物天師栗的干燥種子娑羅子中提取得到的一種含酯鍵的三萜皂苷，其具有抗炎、抗滲出，提高靜脈張力，加快靜脈血流，促進淋巴回流，改善血液循環和微循環的作用[3]。臨床上用于腦水腫、創傷或手術所致腫脹，也用于靜脈回流障礙性疾病[4-5]。目前，已開發出七葉皂苷鈉凍干粉針劑、七葉皂苷鈉搽劑、復方七葉皂苷鈉凝膠、七葉皂苷鈉片等劑型[6]。

變應性接觸性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD) 是T細胞介導的針對皮膚接觸致敏原的免疫反應[7]，是最常見的皮膚病之一，具有難預防、發病機制復雜多樣的特點。減少炎性細胞聚集、促進皮膚屏障功能恢復是目前治療ACD的一個突破口。小鼠耳廓ACD 模型是最常用的小鼠ACD 模型，已有數十年歷史[8]。該模型用耳廓作為皮炎的靶部位，根據炎癥耳廓的厚度及單位面積炎細胞數來判斷抗皮炎藥物的療效。DNCB丙酮液是一種常見的致敏劑，可致敏和激發動物皮膚出現典型的接觸性皮炎損害，在制作變應性接觸性皮炎動物模型中被廣泛應用[9-10]。該模型具有在二次抗原激發時不需要剔除毛發，炎細胞浸潤數量多等優點。研究表明七葉皂苷鈉對抗炎具有一定作用，但是其對ACD是否有抑制作用少有報道，本研究通過建立2,4-二硝基氯苯( DNCB) 誘發的小鼠ACD模型，研究七葉皂苷鈉對小鼠ACD的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級昆明小鼠，體重18～22 g，60只，雌雄各半，由湖北省實驗動物研究中心提供，實驗動物使用生產許可證號：SYXK(鄂)2016-0089，實驗動物質量合格證號：NO.42816300002333，實驗動物設施使用證明編號：NO.00263059。每籠5只，只有進食和飲水，飼養于本單位SPF級小鼠實驗室。實驗室溫度20～25℃，濕度40%～70%。

1.2 試劑和儀器 2,4-二硝基氯苯(DNCB)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)，復方醋酸地塞米松乳膏(批號：1802010S，華潤三九醫藥股份有限公司)，七葉皂苷鈉(批號：170410A，武漢愛民制藥有限公司)，電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)，倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠ACD模型的建立 按參考文獻建立模型[11-15]，小鼠腹部脫毛(3 cm× 3 cm)后，用5% DNCB 丙酮橄欖油(丙酮/橄欖油=4∶1)溶液100 μL致敏，第2天再次涂100 μL強化致敏。第5天小鼠右耳內外側耳面涂以1%DNCB丙酮橄欖油溶液20 μL進行激發。

1.3.2 分組和給藥 實驗動物隨機分為6組，分別為：正常對照組、模型組、陽性對照組和七葉皂苷鈉組(分為低、中、高給藥組，其濃度分別為1.8、3.6和7.2 mg/kg)，每組10只，雌雄各半。正常對照組給予等量生理鹽水，按人與小鼠劑量換算公式，小鼠復方醋酸地塞米松乳膏用量為10 mg/kg。所有藥物均于致敏前1 d 將受試物均勻涂于各小鼠右耳的正反兩面，每日1次，連續給藥7 d。除空白對照組，其它各組于給藥第2、3天進行致敏和強化致敏，給藥第6天各組進行激發。

1.3.3 小鼠ACD模型評價指標 激發前、激發后48 h分別對小鼠耳部紅斑、水腫、抓痕進行評分作為耳部皮損情況評價指標，評分標準見表1；耳部皮損情況評分為建模成功與否及過敏反應程度的評價指標。

表1 小鼠耳部紅斑、水腫、抓痕評分標準

1.3.4 小鼠耳廓腫脹度和脾指數測定 激發后48 h安樂死處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用7 mm 打孔器分別在兩耳同一部位打下耳片，稱重，以兩耳片的重量差異為腫脹度。耳廓腫脹抑制率計算如下：抑制率(%) = (模型對照組腫脹度-實驗組腫脹度) /模型對照組腫脹度 × 100%。同時取小鼠脾臟稱重，以每10 g體重的脾質量作為脾指數。

1.3.5 小鼠耳廓組織病理學檢查 激發后48 h，每組分別取5只小鼠，取右耳皮膚組織標本經石蠟包埋固定，制成5 μm薄層切片，以蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)進行染色，并使用光學顯微鏡觀察皮膚組織的病理變化，主要包括真皮水腫程度、炎癥細胞浸潤及其數目變化等情況。

2 結果

2.1 小鼠ACD模型評價指標 小鼠經耳部給予1% DNCB，激發30 min后，可見耳部激發處皮膚開始紅腫，小鼠搔抓現象明顯；48 h后模型組小鼠耳部紅腫明顯，陽性對照組和不同劑量給藥組耳部紅腫出現不同程度的緩解，陽性對照組基本恢復正常，不同劑量給藥組耳部紅腫呈現劑量依賴性趨勢，表明小鼠 ACD 模型成功建立。小鼠耳部皮膚狀況，評價指標結果見表2。

組別劑量/mg/kg 耳變態評/分 致敏前激發后48h正常對照組00.0±0.0模型對照組05.2±0.8##陽性對照組00.0 ± 0.0**低劑量組1.803.2±0.6**中劑量組3.602.0±0.5**高劑量組7.200.9±0.1**

注：與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組藥物對ACD模型小鼠耳腫脹度的影響 七葉皂苷鈉給藥組和陽性對照組均能對DNCB所致的小鼠耳廓腫脹有明顯抑制作用，其中高、中劑量組均可明顯抑制DNCB誘發的小鼠耳廓腫脹，與模型組比較差異有顯著統計學意義(P<0.01)，并且高劑量組的腫脹抑制率(76.05%)與模型組(79.10%)接近，各劑量組的效果呈現劑量依賴關系趨勢。見表3。

組別耳腫脹度/mg耳廓腫脹抑制率/%正常對照組0.00±0.00100模型組8.85±1.51##陽性對照組1.85±0.31**79.10低劑量組6.50±1.5426.14中劑量組4.54±0.46**48.86高劑量組2.12±0.49**76.05

注：與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 小鼠ACD模型耳廓皮膚組織病理變化 空白對照組耳組織整體結構輕度異常，表皮細胞排列整齊(粗實線箭頭)，真皮層細胞無明顯水腫變性，組織無明顯炎癥細胞浸潤。模型組耳組織整體結構異常，可見部分表皮細胞壞死變性(粗實線箭頭)；真皮層膠原纖維排列紊亂，真皮層細胞可見廣泛水腫部分胞漿空泡化(細實線箭頭)；且組織可見大量炎癥細胞浸潤(細虛線箭頭)。七葉皂苷鈉低劑量組耳組織整體結構基本正常，真皮層細胞可見輕微水腫(細實線箭頭)，組織無明顯炎癥細胞浸潤。中劑量組耳組織整體結構基本正常，真皮層細胞減少，無明顯水腫變性，組織可見少量炎癥細胞浸潤(細實線箭頭)。高劑量組的耳組織整體結構基本正常，真皮層細胞無明顯水腫變性，組織無明顯炎癥細胞浸潤。七葉皂苷鈉3個劑量組表皮細胞間和細胞內輕度水腫，以及炎癥細胞浸潤都有一定程度的減少。表明七葉皂苷鈉對DNCB誘導的ACD模型有明顯的抑制作用。結果如圖1所示。

2.3 各組藥物對ACD模型小鼠脾指數影響 陽性對照組小鼠的脾指數低于正常對照組，而七葉皂苷鈉各劑量組小鼠脾指數均高于空白對照組，顯著低于模型組(P<0.05)。復方醋酸地塞米松乳膏為糖皮質激素類藥物，有免疫抑制作用，用藥后小鼠脾指數降低。七葉皂苷鈉各組可能通過增強機體的細胞免疫、促進免疫器官發育、恢復異常體液免疫功能，使免疫系統趨于平衡來發揮作用，使得小鼠脾指數降低。結果見表4。

組別劑量/mg/kg脾指數/10mg/g正常對照組27.79±1.62模型組61.34±2.51##陽性組18.60±4.46##**低劑量組1.850.25±7.47*中劑量組3.645.79±7.40**高劑量組7.245.57±4.94**

注：與正常對照組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

ACD是最常見的皮膚病之一，具有難預防、發病機制復雜多樣的特點，治療的常用藥中，抗組胺藥對炎癥介質組胺有拮抗作用，對I型超敏反應有效，但不能抑制IV型超敏反應病變部位的炎細胞浸潤；糖皮質激素類雖然顯效快、作用強、療效確切，但長期應用可誘發腎上腺皮質功能亢進或減退，存在反跳現象和停藥綜合癥，因而不適合長期臨床應用[11]。小鼠耳廓ACD 模型用耳廓作為皮炎的靶部位，根據炎癥耳廓的厚度及單位面積炎細胞數來判斷抗皮炎藥物的療效。孫明立等[16]建立豚鼠和小鼠ACD模型，驗證了DNCB誘導ACD模型的可行性，且小鼠相較于豚鼠具有模型制作時間更短，對致敏物敏感性較強的優點。研究對七葉皂苷鈉治療ACD藥效進行了初步研究，結果表明七葉皂苷鈉在治療ACD方面療效明顯，且無糖皮質激素類藥物類副作用，提示七葉皂苷鈉在治療ACD中具有一定的優勢，其相關作用機制還有待進一步研究。