地龍降壓膠囊對自發性高血壓大鼠凝血相關的血小板miRNAs的影響

王碧瑩 李應東 劉永琦,2 張小平,2* 岳曉華 李長天 謝曉蓉 孫少伯

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學敦煌醫學與轉化省部共建教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

地龍是傳統中藥，具有通經活絡的功效，常用于治療經脈不暢等病癥。現代研究發現地龍具有抗凝血、改善血液循環等作用[1]。臨床運用地龍降壓膠囊治療高血壓有一定的療效，但其降壓機制尚不明確。研究表明老年性高血壓和妊娠性高血壓與血小板活化有一定的聯系，此類高血壓患者普遍處于高凝狀態，血壓升高時易引起血管內皮損傷，促使內皮細胞釋放活性物質，引起血小板聚集，導致血小板血栓形成[2]。研究通過地龍降壓膠囊對幾種凝血相關的血小板miRNAs的影響，探討其降壓機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，8周齡，SPF級，雄性，實驗期間給予標準飼料，自由飲食飲水。

1.1.2 儀器 QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀(ABI)；Nano-100微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)；熒光定量PCR管(EXTRAGENE)；EDC-810 PCR儀(東勝創新生物科技有限公司)；JY300水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；JY02S紫外分析儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。

1.1.3 藥物與試劑 地龍降壓膠囊(批號：151026，甘肅中醫藥大學附屬醫院院內制劑)；Trizol(批號：15596-026，Ambion)；HiScript Reverse Transcriptase(批號：R101-01/02，VAZYME)；5×HiScript Buffer(批號：R101-01/02，VAZYME)；ddH2O(批號：C1D230A，genecopoeia)；Ribonuclease Inhibitor(批號：LOT#J11202，Tr-ansGen)；dNTP Mixture(批號：LOT#M1123，TIANGEN)；50×ROX Reference Dye 2(批號：Cat.#D01011A，VAZYME)；SYBR Green Master Mix(批號：Cat.#D01010A，VAZYME)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 參考文獻[3]將SHR大鼠適應性喂養1周后測血壓，按照收縮壓值隨機分為5組，每組8只：①正常對照組：等體積蒸餾水灌胃；②肝素陽性對照組：肝素500 IU/kg尾靜脈注射，每日1次；③地龍降壓膠囊低劑量組；④地龍降壓膠囊中劑量組；⑤地龍降壓膠囊高劑量組；以上三組參考文獻[4]分別灌胃地龍降壓膠囊25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg(膠囊內干粉溶于37℃溫水)，每日2次，早晚各1次。以上各組共處理15 d后處死大鼠，取血液保存。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測mRNA Trizol法提取總RNA，逆轉錄成cDNA，8倍稀釋后應用qPCR檢測血小板相關5種miRNAs變化水平，計算公式為Folds=2-△△Ct，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。引物序列表如表1所示。

表1 引物序列

2 結果

2.1 miRNA-223的表達 各組的熔解曲線為單峰，沒有出現雜峰和主峰的異常增寬，說明模板濃度合理；擴增曲線提示擴增效率良好。研究發現miRNA-223能夠作用于P2Y12蛋白從而激活血小板的活化功能[5-6]，其表達量下降時抗凝血功能增強。由圖1可知，地龍降壓膠囊高劑量組的miRNA-223的表達量比正常對照組顯著降低(正常：高劑量，1∶0.539)(P<0.01)，肝素陽性對照組的miRNA-223也出現類似的情況，提示藥物干預會造成血小板活性降低。

2.2 miRNA-96的表達 研究發現囊泡相關膜蛋白-8(vesicle associated membrane protein8，VAMP-8)可激活血小板的活化，miRNA-96可通過降低其含量抑制血小板活化[7]，其表達上調具有抗凝血的作用。由圖2可知，地龍降壓膠囊高、中、低劑量干預后miRNA-96表達量分別是正常對照組的7.56、4.45、2.46倍(P<0.01)，可能藥物干預后血小板的活化被抑制。

2.3 miRNA-130a的表達 體內外研究表明，糖蛋白Ⅱb可促進血小板的聚集，miRNA-130a通過減少其基因表達從而影響血小板的聚集過程[8]。由圖3可知，肝素陽性對照組和地龍降壓膠囊高劑量組的miRNA-130a表達量明顯升高，分別是空白組的5.989倍、5.495倍(P<0.01)，說明地龍降壓膠囊對血小板的聚集明顯有抑制作用。

2.4 miRNA-155的表達 miRNA-155在造血干細胞中過表達能抑制巨核細胞生成、分化，從而抑制血小板產生[9]。由圖4可知，與空白對照組相比，其余各組的miRNA-155表達量無明顯差異(P>0.05)，分別是1.136、0.983、1.717、1.054，證明地龍降壓膠囊對血小板產生沒有抑制性影響。

2.5 miRNA34a-5p的表達 ICHIMURA等發現miRNA34a-5p能促進巨核細胞生成，從而提高血小板生成[10]。由圖5可知，地龍降壓膠囊高中低劑量干預組miRNA34a-5p的表達量跟正常對照組相比均無統計學差異(P>0.05)，可能地龍降壓膠囊對血小板的生成無促進作用。

3 討論

地龍別名蚯蚓，《本草綱目》記載：“性寒而下行，性寒故能解諸熱疾，下行故能利小便，治足疾而通經絡也”。此藥歸肝、脾、膀胱經，能通絡平喘，適用于多種原因導致的經絡阻滯、血脈不暢等癥狀。

高血壓患者常伴有凝血功能的改變，周身微小血管暴露在高血壓病理狀態下，易出現內皮細胞結構改變和功能失調，進而促進血小板的活化作用[11]。研究發現高血壓患者的平均血小板體積(MPV)增大，血壓與MPV成正比，代表血小板活性增強[12]，加速血栓形成。目前，SHR是最接近人類原發性高血壓病的動物模型，其特點為高血壓自發率100%，在4～6周齡期間自發形成高血壓，并且表現出持續性的血壓增高，6個月可至最高水平。既往研究發現，SHR動物模型與人類原發性高血壓的病理基礎相似，存在高凝及纖溶亢進狀態[13-14]。因此，本實驗選用SHR為研究對象進行探討。

地龍降壓膠囊的主要成分為地龍蛋白提取物，具有溶血栓和抗凝血功效[15]。富含纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶等，影響體內的凝血系統[16]。本研究中將miRNAs作為指標來監測地龍降壓膠囊對血小板的影響，研究首先涉及與血小板活化作用相反的兩種miRNAs：miRNA-223通過Ago2-mir-223復合物調節P2Y12(腺苷二磷酸受體)的表達，從而啟動血小板的活化[17]，而miRNA-96可以通過降低VAMP-8的含量降低血小板的活化[18]。地龍降壓膠囊干預后miRNA-223的表達量下降(見圖1)，miRNA-96的表達上調(見圖2)，表明地龍降壓膠囊對血小板的活化有一定抑制作用，通過對血小板活化的抑制抗凝血。對miRNA-130a的檢測發現，其表達明顯上調(見圖3)，miRNA-130a是通過抑制轉錄因子MAFB的表達，減少糖蛋白Ⅱb基因表達，從而抑制血小板的聚集[19]。結果說明地龍降壓膠囊可能通過促進miRNA-130a的表達，進而抑制血小板的聚集。

另外，研究也涉及到與血小板生成相關的兩種miRNAs：miRNA-155和miRNA34a-5p。miRNA-155通過抑制巨核細胞的生成、分化，從而抑制血小板產生，而miRNA34a-5p通過促進巨核細胞生成的途徑提高血小板生成。研究表明，地龍降壓膠囊干預后，miRNA-155和miRNA34a-5p的表達沒有明顯變化(見圖4和5)，表明地龍降壓膠囊可能對血小板的產生既無抑制作用也無促進作用，說明地龍降壓膠囊沒有通過影響血小板生成發揮抗凝血作用。

綜上，地龍降壓膠囊主要引起血小板活化和聚集相關的miRNAs的表達改變，而與血小板生成相關的miRNAs沒有太大變化，證明地龍降壓膠囊可能主要通過抑制血小板活化與聚集而降低凝血作用，進而發揮降壓機制。進一步探討miRNAs在凝血中的作用，尤其是對于與凝血異常相關的老年性高血壓的控制有一定的臨床意義。