畬藥“十二時辰”醇提液皮膚用藥的慢性毒性實驗研究

周春權 趙 立 蔣 暢 李細彬 胡 娟.3

1.福建省中醫藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省寧德市閩東畬族青草藥發展協會，福建 寧德 352100； 3.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122

“十二時辰”為福建福安民間畬醫習用藥，根據《福安畬醫畬藥》記載，其性溫，味辛，具有通經活絡、通關竅、祛風除濕、活血止痛、理氣通便、利尿等功效[1]，黃澤豪等[2]對其進行本草考證，福安“十二時辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮ClematisfloridaThunb.var.plena D.Don的干燥根。重瓣鐵線蓮具有多種生物活性化學成分，林玲等[3]對福安的重瓣鐵線蓮的化學成分進行分析，發現其可能含有氨基酸、蛋白質、還原糖、多糖、皂苷類、生物堿、黃酮類以及少量的酚類和鞣質、有機酸、內酯、香豆素、揮發油、甾體和萜類等化學成分。現代藥理研究表明具有抗炎、抗腫瘤、祛風除濕、解毒消腫等作用。葉麗穎等[4]發現鐵線蓮提取物具有一定的抗氧化能力和抑菌能力，能抑制脂質體過氧化，清除超氧陰離子；能抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌的生長。

“十二時辰”作為畬族民間習用藥，具有鮮明的地方與民族特色。當地居民用“十二時辰”泡酒，藥液作為皮膚外用藥，用來治療跌打損傷，關節腫痛等。本實驗室前期觀察到“十二時辰”水煎劑小鼠灌胃急性毒性的半數致死量為60.08g/kg[5]。為分析“十二時辰”醇提液作為皮膚用藥的毒性，項目組參照《中藥藥理研究方法學》皮膚用藥毒性試驗方法[6]，進行“十二時辰”皮膚用藥慢性毒性試驗，現報告如下。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 新西蘭家兔，雌雄各半，(1.5±0.2) kg，購自上海市松江區松聯實驗動物場，合格證號：20170008000087。

1.2 藥物 “十二時辰”生藥(閩東畬族青草藥發展協會提供)，經福建中醫藥大學范世明教授鑒定為毛茛科植物重瓣鐵線蓮ClematisfloridaThunb.var.plena D.Don 的干燥根,本實驗采用65%的乙醇提取濃縮制備，每毫升含生藥1.0 g。 詩妃脫毛膏(批號：PSHG028，廣州詩妃生物科技有限公司)。

1.3 儀器 YP502N電子天平(上海精密科學有限公司)；AU480全自動生化儀(貝克曼)；XT2000i全自動血液分析儀(SYSMEX)；DMi8顯微鏡(LEICA)

2 方法

2.1 分組 通過前期的皮膚用藥急性毒性試驗，未觀察到毒性反應，可能是毒性較小，則采用最大濃度最大耐受量進行家兔慢性毒性試驗，最大濃度為1.0 g/mL原藥材。將健康的新西蘭家兔隨機分成4組，即正常對照組(涂賦形劑30%乙醇)、“十二時辰”高劑量組(1.0 g/mL)、中劑量組(0.5 g/mL)、低劑量組(0.25 g/mL)，每組6只，雌雄各半。

2.2 給藥方法與觀察[7]給藥前24 h先用電推剪在背部剃毛，然后用詩妃脫毛膏脫毛，脫毛面積約150 cm2。給藥途徑與臨床一致，采用皮膚給藥，每只家兔脫毛區固定時間涂藥5 mL，涂藥后用紗布固定, 家兔分籠飼養，連續用藥30 d。末次給藥后動物禁食不禁水16 h，用10% 的水合氯醛進行腹腔注射麻醉。將麻醉后的動物仰臥固定，使用一次性采血針從腹主動脈采血，血樣用于血常規和血生化檢測。采血完后處死動物，解剖動物，摘取動物下列臟器：腦、心、肝、脾、肺、腎(單側)、胸腺、腎上腺(單側)、睪丸(單側)、附睪(單側)子宮、卵巢(單側)分別稱重，并計算主要臟器系數。計算公式如下：

臟器系數=臟器重量/體重×100%

2.3 HE染色病理切片 檢查稱重后，各臟器均浸入4%多聚甲醛溶液中進行固定，用于HE(hematoxylin-eosin staining)染色病理切片。將固定后的主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)進行修樣后，在脫水機內進行梯度脫水及透明。將脫水后的樣本取出，進行石蠟包埋。將包埋后的組織樣本固定在切片機上切片，然后在溫水(42～46℃)中展平、貼片，最后置入烘箱內過夜烘干。次日在二甲苯和乙醇濃度梯度中使切片脫蠟，然后進行HE染色，最后進行顯微鏡檢查并拍照。

2.4 統計學方法 資料采用SPSS14.0 軟件進行統計分析，方差齊時兩均數比較用LSD，方差不齊用秩和檢驗，進行統計學分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況和體重增長的影響 用藥組與對照組相比，未觀察到家兔的活動、 飲食、皮毛光澤的異常，家兔體重隨時間推移而增加，與正常對照組比無明顯變化(P>0.05)(見表l) 。結果顯示“十二時辰”醇提液皮膚用藥30 d對家兔的體重變化無影響。

組別 實驗前體重/kg實驗后體重/kg低劑量組2.317±0.0262.767±0.075中劑量組2.333±0.0412.717±0.113高劑量組2.325±0.0272.783±0.098正常對照組2.350±0.0452.775±0.094

3.2 對家兔主要臟器的臟器系數的影響 取家兔心、腦、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器稱重并計算其臟器指數，結果發現各組家兔主要臟器的臟器系數與正常對照組比較均無統計學差異(P>0.05)。 說明“十二時辰”醇提液皮膚用藥30天對家兔的主要臟器無影響。見表2。

3.3 對家兔血常規的影響 取各組家兔的血清進行血常規檢查，各給藥組連續涂抹“十二時辰”醇提液30 d后對家兔血常規無明顯影響，均在正常值范圍內。見表3。

3.4 對家兔血液生化的影響對各組家兔血清進行血液生化檢測，給藥組連續涂抹“十二時辰”醇提液30 d后對家兔血生化指標無明顯影響，均在正常值范圍內。見表4。

3.5 對組織學的影響 取各組家兔的心、肝、脾、肺、腎、等各臟器組織進行HE染色，顯微鏡拍照，由圖1可知，“十二時辰”醇提液皮膚用藥30 d對家兔主要臟器的組織形態正常，界限分明，未見明顯異常。

組別肺胸腺腎上腺睪丸附睪子宮卵巢低劑量組0.37±0.0330.16±0.0140.004±0.00020.037±0.0050.037±0.0030.019±0.0010.004±0.0004中劑量組0.37±0.0280.17±0.0080.004±0.00050.048±0.0070.053±0.0110.019±0.0010.003±0.0007高劑量組0.39±0.0370.18±0.0210.005±0.00060.039±0.0060.034±0.0060.020±0.0010.004±0.0001正常對照組0.36±0.0260.17±0.0070.004±0.00030.038±0.0050.037±0.0000.019±0.0010.004±0.0003

續表2

組別平均血小板體積血小板體積分布寬度血小板壓積/%大血小板細胞數/109/L大血小板細胞比例/%低劑量組5.92±0.6615.02±0.220.19±0.0323.40±2.706.44±2.05中劑量組5.94±0.5815.18±0.560.23±0.0626.80±4.767.08±2.78高劑量組5.90±0.5315.00±0.300.24±0.0525.40±5.136.66±2.55正常對照組6.04±0.4815.34±0.400.21±0.0524.60±5.226.94±2.89

續表3

續表3

續表3

組別總蛋白白蛋白球蛋白谷丙轉氨酶谷草轉氨酶尿素氮肌酐尿酸高劑量組56.20±2.5443.47±2.3312.73±0.9350.55±12.0726.27±8.967.63±0.8295.08±6.8017.57±8.45中劑量組58.40±2.7443.68±2.8414.75±1.1552.02±14.5330.88±7.297.79±1.11100.65±5.3318.18±6.08低劑量組54.95±2.7241.52±1.4414.22±3.2747.12±9.1428.32±6.387.14±0.7794.98±8.6619.57±5.72正常對照組55.62±3.5843.92±2.1012.73±0.4449.63±7.4228.98±5.617.48±0.7993.97±6.1018.47±7.44

續表4

4 討論

實驗室前期對“十二時辰”水煎劑作為內服的毒性進行了評價，發現其水煎劑小鼠灌胃有一定的毒性作用，半數致死量 (LD50)為60.08g/kg[5]。其口服有一定的毒性反應，那么作為外用制劑，是否也會有一定的毒性反應。本實驗室采用醇提液進行了一系列的皮膚用藥安全性評價試驗，皮膚給藥急性毒性試驗、皮膚刺激試驗、皮膚過敏試驗，均未見毒性反應。

本次實驗用十二時辰對家兔皮膚進行30 d涂皮實驗研究，在本實驗條件下，30 d涂皮試驗的3個劑量組(5.0、2.5、1.25 g生藥/只)，其體重、血常規和生化檢測指標，與正常對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，HE染色病理組織學檢查結果也表明各試驗組家兔的心、肝、脾、肺、腎睪丸、卵巢等組織均未見病理性損傷。表明該樣品外用涂皮對家兔的生長發育無不良影響。對畬藥“十二時辰”醇提液外用于活血化瘀，治療跌打損傷，關節腫痛等臨床具有積極的參考價值。

畬藥“十二時辰”屬于福建福安地區畬族藥，在當地已有100多年的使用歷史，具有鮮明的地方與民族特色，現在當地開始進行大量的人工栽培，是當地農民經濟收入來源的一大部分，其在畬族民間也得到廣泛應用，民間既可用它作為觀賞性花卉，又可用它泡酒或熬湯當作內服，還有的用它做成洗劑和搽劑用作外用。但目前對“十二時辰”的藥理藥效研究較少，特別是安全性方面的實驗評價。為了有效避免民間應用時可能造成不良反應，為保障福建草藥民間的用藥安全。本實驗結果為“十二時辰”的外用制劑的開發利用提供了科學依據，從而為帶動當地畬族的經濟和畬醫畬藥的發展提供一些理論基礎。