黑木耳花青素提取工藝的優化及其抗氧化活性研究

楊艷，祁平，吳永妮，霍彩燕，趙玉英，*

（1.太原科技大學化學與生物工程學院，山西太原030006；2.長江大學農學院，湖北荊州434000）

花青素（anthocyanin）又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中具有多種生理活性的水溶性色素，是植物的主要呈色物質[1-2]；自然狀態下，花青素常以糖苷形式存在，又稱為花色苷[3-4]，在酸性條件下其呈紅色，在堿性條件下呈藍色[4-6]。大量研究發現花青素具有抗氧化、抗衰老、預防心腦血管疾病、抑制腫瘤細胞發生等多種生理功能；在食品、保健品、藥品中也有廣泛的應用[6-10]。

黑木耳（Auricularia auricula）屬真菌類擔子菌綱，木耳目、木耳科、木耳屬[11]。作為藥食同源真菌，古籍《本草綱目》中對黑木耳有如下闡述：性平、味甘、補氣止血、澀腸活血；而且自古以來都有以黑木耳入藥的記載。最新基因組測序的結果也表明我國東北地區3 個主要黑木耳品種含有可代謝出抗腫瘤、抗衰老產物的基因[12]。同時黑木耳中含有豐富的甘露聚糖、甘露糖、葡萄糖、木糖等碳水化合物，富含人體必需的蛋白質、膳食纖維及黃酮類成分[13-14]。

目前對黑木耳中花青素提取及活性鑒定等報道相對較少，本文首先考察了液料比、提取試劑、溫度和時間等單因素對黑木耳花青素提取率的影響，進一步正交優化提出黑木耳花青素的最佳提取工藝；通過羥自由基、DPPH 自由基、H2O2及超氧陰離子自由基的清除作用研究黑木耳花青素的抗氧化活性；進一步評價了黑木耳花青素對大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等致病菌的抑制作用。本文研究結果將為黑木耳花青素的規模化生產及黑木耳類功能性食品的開發等提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

黑木耳：山西太原南堰市場；D101 型大孔吸附樹脂：天津南開大學化工廠；無水乙醇、甲醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、鹽酸、水楊酸、H2O2、FeSO4等（均為分析純）：正合生物科技有限公司；DPPH：Sigma 公司；VC：中國醫藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2 儀器

HH-2 電熱恒溫水浴鍋：蘇州威爾試驗用品有限公司；QE-100 粉碎機、101 型烘箱：北京中興偉業儀器有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；721 紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；ST16R 高速臺式冷凍離心機：美國熱電公司。

1.3 供體菌

大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由太原科技大學生物化學實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 黑木耳花青素的提取和純化

黑木耳花青素提取、純化及檢測流程見圖1。

圖1 黑木耳花青素提取及檢測Fig.1 Extraction and research of anthocyanins from Auricularia auricula

酸化乙醇提取液為1.5 %鹽酸的無水乙醇，過夜浸泡后55 ℃～60 ℃溫水浴提取4 h，經過濾后4 800 r/min 離心取上清液得花青素粗提物；D101 大孔樹脂濕法裝柱，將花青素粗提液上柱結合30 min，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液真空濃縮得花青素精提物，4 ℃保存備用。

2.2 花青素標準溶液的測定

分別取 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 花青素標準液（濃度 5 μg/mL）定容至 5 mL，515 nm 處測吸光值。以花青素濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明吸光值A515與花青素濃度C（g/L）的關系為：A515=0.21C-0.004，其中R2=0.997 7，擬合度良好。

2.3 單因素試驗

首先確定提取試劑，分別選擇蒸餾水、無水乙醇、無水甲醇、酸化乙醇、5%檸檬酸-水溶液和15%檸檬酸-水溶液各20 mL 與0.5 g 黑木耳粉浸泡12 h，經55 ℃～60 ℃水浴提取2 h，取上清液經濃縮、過濾后，515 nm 處測定吸收值并按照公式（1）計算花青素提取量。

式中：C 為最佳提取條件下花青素樣品濃度，g/L；V 為提取液定容體積，mL；m 為樣品的質量，g；n 為稀釋倍數。

在最佳提取試劑條件下，選取液料比、提取溫度和提取時間作為3 個影響因素分別提取黑木耳花青素。其中液料比選擇 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）5 個水平；提取溫度選擇 40、50、55、60、65 ℃ 5 個水平；提取時間選擇 30、45、60、75、90 min 5 個水平。各提取水平分別做3 組平行試驗，數據以平均值±標準誤表顯示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.001 差異極顯著，P＜0.05 差異顯著，P＞0.05 差異不顯著。

2.4 正交優化試驗

選擇最佳提取試劑，在單因素試驗基礎上，以液料比（A）、溫度（B）和時間（C）為自變量，提取率為響應值，設計L9（34）的三因素三水平正交優化試驗，得到黑木耳花青素最佳的提取工藝。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

2.5 黑木耳花青素的抗氧化活性分析

2.5.1 羥自由基（·OH）清除能力測定

分別取等量花青素提取液，各加入1.0 mL FeSO4（0.15 mmol/L）、0.4mL 水楊酸（2 mmol/L）、1.0 mL H2O2（6 mmol/L）、0.4 mL 超純水，均勻混合后置于 37 ℃恒溫水浴1 h，冷卻后于515nm 測OD 值。抗壞血酸作為陽性對照，按公式（2）計算黑木耳花青素對·OH 的清除率。

2.5.2 DPPH 自由基清除能力測定

取0.5 mL 不同濃度黑木耳花青素提取液，分別加入0.004%的DPPH 溶液2.5 mL，均勻混合后置于37 ℃恒溫水浴30 min 后終止反應，冷卻至室溫25 ℃并進一步測定 515 nm 處 OD 值，按公式（2）計算 DPPH 自由基清除率。

2.5.3 H2O2清除能力測定

將H2O2溶于0.1 mol/L pH 7.4 的磷酸緩沖溶液，配置成40 mmol/L H2O2溶液。分別取3.4 mL 不同濃度黑木耳花青素提取液，均勻混入H2O2溶液0.6 mL。3.4 mL水和0.6 mL 的磷酸緩沖液調零，波長230 nm 處測定OD230值并計算黑木耳花青素對H2O2的清除率。2.5.4 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

6 支試管分別加入 4.0 mL Tris-HCl 緩沖液（0.2 mol/L，pH 8.2），依次加入 1.0 mL 不同濃度黑木耳花青素提取液，25 ℃恒溫水浴反應4 min 后立即加入2 滴8 mol/L HCl 終止反應，并測定420 nm 處OD420值。以抗壞血酸作為陽性對照，計算黑木耳花青素對O2-·的清除率。

進一步將樣品體積與其自由基清除率進行線性回歸，計算清除50%自由基時所需的樣品濃度，即IC50。

2.6 黑木耳花青素的抑菌活性分析

抑菌測定采用濾紙片擴散法，6 mm 高壓滅菌濾紙片用不同濃度黑木耳花青素提取液浸泡1 h 制成藥敏紙片備用。空白對照以無菌生理鹽水和乙醇浸泡制得。分別取菌體密度105CFU/mL 的菌懸液均勻涂布平板，吸收30 min 用無菌鑷子夾取藥敏紙片緊貼于含菌培養基表面，每皿3 片。測定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）值，以及利用生長曲線法評價黑木耳花青素的抑菌活性。具體操作為：以無菌牛肉膏蛋白胨培養基作為稀釋液，將培養12 h的菌液進行25 倍稀釋，各取3 mL 稀釋菌液分裝入滅菌培養管；1 號管為空白對照管，2 號陰性對照管，其余6 支無菌試管依次添加不同濃度花青素提取液，提取液終濃度見表2。培養結束后依次測定吸光值。

表2 抗金黃色葡萄球菌及抗大腸桿菌試驗組中花青素提取物終濃度Table 2 Final concentration of anthocyanin extract in anti-S.aureus and anti-E.coli experimental groups

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 不同提取試劑對黑木耳花青素提取的影響

分別選擇酸化乙醇、無水乙醇、無水甲醇、蒸餾水、5%和15%檸檬酸-水溶液，在相同處理條件下提取黑木耳花青素，不同提取試劑對黑木耳花青素提取的影響見圖2。

結果顯示黑木耳花青素較易溶解于乙醇、甲醇等有機溶劑，其中乙醇提取效果最好，其中乙醇和酸化乙醇浸提花青素，其提取率可達到8.0%及以上。結合文獻[6，15]及實際生產，本試驗選擇酸化乙醇作為提取試劑進行提取工藝的優化。

3.1.2 不同液料比對黑木耳花青素提取的影響

選取液料比分別為 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）5 個水平，60 ℃提取 2 h。不同液料比對黑木耳花青素提取的影響見圖3。

圖2 不同提取試劑下黑木耳花青素的提取得率Fig.2 Extraction rates of different extraction reagents

圖3 不同液料比下黑木耳花青素的提取得率Fig.3 Extraction rate under different ratios of liquid to material

結果可知，黑木耳花青素的得率隨液料比的變化而存在顯著性差異（P=0.009），其中液料比為25 ∶1（mL/g）時，花青素溶出率最大。因此，本試驗中液料比控制為25 ∶1（mL/g）水平。

3.1.3 不同提取溫度對黑木耳花青素提取的影響

進一步驗證不同提取溫度對黑木耳花青素提取效果的影響。不同提取溫度對黑木耳花青素提取的影響見圖4。

圖4 不同提取溫度下黑木耳花青素提取得率Fig.4 Extraction rate at different extraction temperatures

結果可知，在其他因素不變的情況下，黑木耳花青素得率隨提取溫度的上升而增加，溫度為55 ℃時花青素提取率達到最大，顯著性檢驗結果為P=0.038＜0.05，因此溫度變化對花青素提取率的影響顯著。但是進一步隨溫度上升，其他易溶物析出，花青素提取率下降。

3.1.4 不同提取時間對黑木耳花青素提取的影響

不同提取時間對黑木耳花青素提取的影響見圖5。

圖5 不同浸提時間下黑木耳花青素的提取得率Fig.5 Extraction rates at different leaching times

提取結果表明，隨著浸提時間的延長，花青素質量分數呈現先上升后下降的趨勢，60 min 溶出率達到最大。但進一步加大提取時間，受溫度及溶液中易氧化物質的影響花青素得率下降。

3.2 最佳提取工藝的確定

單因素試驗基礎上，選擇液料比（A）、溫度（B）、時間（C）為研究對象，以提取率為評價指標，采用三因素三水平正交試驗研究不同提取條件黑木耳花青素的提取效果，因素水平表如表3 所示。

表3 正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal experimental design and results

結果分析表明，因素B 的極差最大，溫度是影響提取率的最顯著因素，其他依次為液料比和時間；因此以酸化乙醇為提取劑，黑木耳花青素的最佳提取條件為B3A1C1，即溫度 60 ℃，時間 60min，液料比 20 ∶1（mL/g）。

3.3 黑木耳花青素抗氧化的活性研究

黑木耳著色較深，富含大量還原性成分。進一步對其提取物進行·OH、DPPH·、O2-·以及 H2O2清除能力的測定，其結果可以間接反映其抗氧化能力。黑木耳花青素提取物的抗氧化試驗結果見圖6。

圖6 黑木耳花青素抗氧化活性及IC50 評價結果Fig.6 Comparison of antioxidant activity from Auricularia auricular anthocyanin extract

結果表明，不同濃度黑木耳花青素提取物對·OH，DPPH·，H2O2以及O2-·清除能力趨勢基本相同；隨著花青素濃度的增加，清除能力逐漸增強，且清除能力均高于抗壞血酸標準品。其中黑木耳花青素清除·OH 和清除H2O2的能力較強，當花青素濃度達到29 mg/L 左右時，對·OH 和H2O2的清除率可達到95%以上，而抗壞血酸對·OH 和H2O2的清除率僅為50%。計算黑木耳花青素分別清除4 種自由基的IC50值，結果發現黑木耳花青素清除·OH 的能力最強，IC50為3.75 mg/L，VC的 IC50為 24.10 mg/L；清除 O2-·的能力最差，IC50為28.00 mg/L，VC的 IC50為 30.81 mg/L。

3.4 黑木耳花青素的抑菌性研究

黑木耳花青素提取物的抑菌性試驗結果見圖7。

圖7 黑木耳花青素對E.coli 生長的影響Fig.7 Effect of anthocyanins on the growth curve of E.coli

試驗表明，對照組中E.coli 培養4 h 后進入對數生長期，但花青素試驗組中E.coli 增長速度減緩，6 h 后E.coli 停止增長且活菌數目下降。因此黑木耳花青素的添加加速E.coli 生長的衰亡期。

進一步通過抑菌圈試驗評價黑木耳花青素提取物對E.coli 和S.aureus 的抑菌效果。結果表明黑木耳花青素對E.coli 和S.aureus 存在一定程度的抑制作用，且隨著花青素質量濃度的增加抑菌圈明顯變大。其中S.aureus 對花青素的敏感性強于E.coli，花青素對S.aureus 的 MIC 及 MBC 為 0.05 mg/mL 和 1.50 mg/mL；對E.coli 的 MIC 及 MBC 分別為 0.08mg/mL 和 2.50mg/mL。

4 結論與討論

大量體內外試驗表明，食品中膳食類黃酮化合物及其代謝產物通過調節不同細胞中的多條通路而發揮其抗氧化作用、酶促作用、受體激活或其他調節作用[16]。該類黃酮類化合物對于抗糖尿病、抗抑郁、預防和治療心血管疾病等方面具有重要療效[17-18]。因此對食品級黃酮化合物的功能特性、構效關系等研究對于功能性食品的開發具有重要的意義。

黑木耳著色淡褐，營養豐富，同時產品高，為我國珍貴的藥食兩用真菌類蔬菜；同時其蘊藏的特殊保健成分，如花青素類物質也為黑木耳的深加工提供一個廣闊發展空間[19]。本試驗以黑木耳花青素得率為指標，分別探討了液料比、提取溫度、提取時間及提取試劑對提取工藝的影響。在單因素試驗基礎上進行正交優選，進一步綜合花青素提取率得出以下結論，溫度是影響黑木耳花青素提取率的最顯著因素，其他依次為液料比和時間。因此以酸化乙醇為提取劑，黑木耳花青素的最佳提取工藝為液料比為20 ∶1（mL/g），提取溫度為60 ℃、提取時間為60 min。在該條件下，黑木耳花青素的提取率最高達12.23%。該結論符合浸提動力學理論，即提取溫度和提取液中離子強度的變化改變了液料中分子吸附、解吸和擴散的運動速度，從而顯著影響了花青素的浸出速率；同時由于黑木耳細胞壁中富含的大量β-葡聚糖和幾丁質等，影響了其內溶物的析出，因此適當延長提取時間和溫度，與花青素擴散溶出乃至提取率的提高等存在顯著相關性。

進一步抗氧化性試驗和抗菌試驗也表明，黑木耳是一種理想的延緩機體細胞衰老、提高機體免疫力、具備抗炎抗瘤等功能的食藥兩用食品。本試驗結果為黑木耳作為一種天然抗氧化劑、抑菌物質的開發提供依據，為黑木耳功能性物質的提取和保健產品的開發提供參考。