HS-SPME/GC-MS測定石榴酒中香氣組分的條件優(yōu)化

張?jiān)骑w，李堅(jiān)斌，2，*，魏群舒，黃嘉雯，方坤

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西南寧530004）

石榴是一種營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值都很高的水果，以石榴為原料釀制而成的果酒，保留了石榴特有的果香，是一種容易被人體吸收的保健酒。在發(fā)酵過程中，石榴酒揮發(fā)性成分發(fā)生變化，形成特有的香氣。香氣是用來鑒定酒類產(chǎn)品優(yōu)劣的品質(zhì)之一[1]，氣相-液相質(zhì)譜聯(lián)用已經(jīng)廣泛應(yīng)用在酒類的香氣成分分析檢測[2-3]。分析酒類中的香氣成分的主要步驟分別是樣品制備和揮發(fā)性組分的提取、濃縮痕量揮發(fā)物、去除雜質(zhì)并分離目標(biāo)特定部分。提取濃縮揮發(fā)性香味物質(zhì)的常用方法有液-液萃取[4]，靜態(tài)和動(dòng)態(tài)頂空分析[5]和蒸餾/萃取[6-7]。將頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）與氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合分析酒中的揮發(fā)性成分準(zhǔn)確且快捷[8]。有許多學(xué)者也進(jìn)行了相關(guān)的研究，Athanasios Mallouchos 等[9]采用 HP-SPME/GC-MS 研究了葡萄酒發(fā)酵過程中揮發(fā)物質(zhì)的變化情況。Dimitra L.Capone 等[10]采用 HP-SPME/GC-MS 定量檢測紅葡萄酒與白葡萄酒中的1，8-桉葉素。Liang Chen 等[11]采用HP-SPME/GCMS 方法定性定量分析了葡萄酒中2-甲基-4-丙基-1，3-氧雜奶氧雜萘。但是采用HP-SPME/GCMS 方法分析石榴酒中的揮發(fā)性成分未見報(bào)道。

本文采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用對石榴酒香氣成分進(jìn)行分析，研究SPME 不同參數(shù)（樣品含量、纖維種類、萃取時(shí)間、萃取溫度）對石榴酒香氣組分的影響，選擇最優(yōu)參數(shù)以準(zhǔn)確的對石榴酒香氣成分進(jìn)行定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴酒：河陰軟籽石榴農(nóng)家自釀；NaCl（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；正構(gòu)烷烴（C7-C30）（色譜純）：美國 SUPELCO 公司；2-辛醇（色譜純）：美國Sigma-Aldrich 公司。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB 固相微萃取頭及萃取手柄：美國Supelco 公司；GC-7890B/5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent 公司；MR-Hei-Standard 磁力攪拌器：美國Heidolph 公司；TLE204E/02 電子天平：梅特勒-托利多儀器公司。

1.2 方法

SPME 萃取纖維的涂層包括聚二甲基硅氧烷（dimethicone，PDMS）、碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carbon molecular sieve/dimethicone，CAR/PDMS）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（dimethicone/divinylbenzene，PDMS/DVB）、二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷等（divinylbenzene/carbon molecular sieve/dimethicone，DVB/CAR/PDMS）。根據(jù)每種纖維涂層的厚度和涂層物質(zhì)種類的不同，每種萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)的吸附和敏感性不同進(jìn)行萃取。

1.2.1 萃取頭的種類對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

將兩組裝有5.0 mL 石榴酒樣品，0.750 0 g NaCl 的頂空瓶于40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min 磁力攪拌器上平衡10 min，選取PDMS 萃取頭和DVB/CAR/PDMS 萃取頭活化后分別置于頂空瓶中萃取40 min。萃取結(jié)束后，將纖維縮回迅速注入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解析3 min 用于GC-MS 分析。

1.2.2 酒樣的體積對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

分別將 3.0、4.0、5.0、6.0 、7.0 mL 酒樣置于 5 個(gè)25 mL 的頂空瓶中，于40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min 磁力攪拌器上平衡10 min，選取萃取頭（1.2.1 優(yōu)化后的萃取頭）活化后于40 ℃萃取40 min。萃取結(jié)束后，將纖維縮回迅速注入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解析3 min 用于GC-MS 分析。

1.2.3 萃取的時(shí)間對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

將5 組裝有一定量體積（1.2.2 優(yōu)化后的體積）的石榴酒樣品，0.750 0 g NaCl 的頂空瓶于40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min 磁力攪拌器上平衡10 min，選取萃取頭（1.2.1優(yōu)化后的萃取頭）活化后在40 ℃分別萃取20、30、40、50 min 和60 min。萃取結(jié)束后，將纖維縮回，迅速注入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解析3 min 用于GC-MS 分析。

1.2.4 萃取溫度對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

將5 組裝有一定量體積（1.2.2 優(yōu)化后的體積）的石榴酒樣品，0.750 0 g NaCl 的頂空瓶于40.0 ℃，轉(zhuǎn)速為500 r/min+磁力攪拌器上平衡10 min，選取萃取頭（1.2.1 優(yōu)化后的萃取頭） 活化后分別在 30.0、35.0、40.0、45.0 ℃和50.0 ℃條件下萃取一段時(shí)間（為1.2.3優(yōu)化的時(shí)間）。萃取結(jié)束后，將纖維縮回迅速注入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解析3 min 用于GC-MS 分析。

1.2.5 GC-MS 測定條件

色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent DB-Wax（60 mm×0.25 mm×0.25 μm）分離揮發(fā)物；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留 3 min，先以 4 ℃/min 的速率升至 120 ℃，再以 6 ℃/min 的速率升至 240 ℃，保持 3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；使用純度為99.999%的氦氣作為載氣進(jìn)行分析，柱流速為1.0 mL/min；采用不分流手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。為消除上次進(jìn)樣殘留對下次進(jìn)樣的影響，讓氣質(zhì)聯(lián)用儀在設(shè)定條件下運(yùn)行一段時(shí)間，每次分析完樣品都要進(jìn)行空樣分析以清洗萃取頭和除去色譜柱中樣品的殘留。

質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；界面和離子源溫度230 ℃；四級桿溫度為 150 ℃；EI 電離源，電子能量70 eV，數(shù)據(jù)在35 amu～500 amu 掃描范圍內(nèi)收集。

1.2.6 圖譜中物質(zhì)的定性與定量

定性分析先通過搜索NIST 14 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，再將碎裂模式與先前報(bào)道的一些文獻(xiàn)進(jìn)行比較，根據(jù)保留指數(shù)鑒定揮發(fā)性化合物。

保留指數(shù)的計(jì)算通過正構(gòu)烷烴C7-C30 采用內(nèi)插值法得到，計(jì)算公式如下：

式中：TR（x），TR（z），TR（z+1）分別代表組分，碳數(shù)為 Z，Z+1 正構(gòu)烷的保留溫度[12]。

采用內(nèi)標(biāo)法對香氣成分進(jìn)行半定量分析（假定校正因子為1），計(jì)算公式為：

式中：Xi為待測化合物的濃度；Ai為待測化合物的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)2-辛醇的峰面積；Cs為石榴酒中添加的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2-辛醇的濃度（濃度為0.82 mg/mL，添加量 6 μL）。

所有測定樣品的GC-MS 總離子流圖中2-辛醇的峰面積保持均一，以確保裝置和方案穩(wěn)定并且結(jié)果是可再現(xiàn)的。

1.2.7 HS-SPME 對石榴酒的重現(xiàn)性

選擇優(yōu)化的HS-SPME 條件，對石榴酒進(jìn)行6 次重復(fù)性試驗(yàn)測定，內(nèi)標(biāo)試劑選擇2-辛醇（濃度為0.82 mg/mL，添加量 6 μL）。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行測定，使用origin 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME條件的選擇

2.1.1 萃取頭的種類對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

GC-MS 離子色譜圖見圖1。

圖1 不同萃取頭萃取石榴酒中香氣組分的GC-MS 圖譜Fig.1 GC-MS spectra of aroma components extracted by different extraction fibers in pomegranate

如圖1 b 所示，萃取頭的纖維涂層使用PDMS 時(shí)，經(jīng)GC-MS 可以檢測出峰103 種，總峰面積為39.1×108。采用DVB/CAR/PDMS 纖維萃取頭的結(jié)果如圖1 a所示，共檢測出峰140 個(gè)，總峰面積為277.4×108。從總峰面積和檢測化合物的數(shù)量來看，采用DVB/CAR/PDMS 纖維萃取頭更具有優(yōu)勢。這種材質(zhì)的纖維是由3 種固定相（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）組合而成，可以提取大量分子量為40～275 的揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物，為試驗(yàn)樣品提供大多數(shù)揮發(fā)性化合物。這與劉敬科等[13]，陳雨等[14]的研究結(jié)果一致。劉敬科等[10]在使用4 種萃取纖維分析小米黃酒中揮發(fā)性成分時(shí)發(fā)現(xiàn)DVB/CAR/PDMS 材質(zhì)的萃取頭對醛、酯等物質(zhì)的吸收具有優(yōu)良的效果。陳雨[14]在用不同的纖維萃取朗姆酒中的香氣組分時(shí)，發(fā)現(xiàn)DVB/CAR/PDMS 材質(zhì)的萃取頭能檢測出醇、酯、醛酮等不同種類的香氣化合物，對朗姆酒中重要的香氣組分（酯類）和高沸點(diǎn)物質(zhì)的吸附能力也明顯優(yōu)于其他單組分材質(zhì)的萃取頭。因此，此種萃取頭相較于其他單組分的纖維，不僅具有更廣泛的吸收面，同時(shí)也具有較好的靈敏性和選擇性，更適合酒類揮發(fā)性物質(zhì)的吸附。

2.1.2 酒樣的體積對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

萃取化合物峰面積和種類如圖2 所示。

圖2 不同的樣品量對石榴酒中揮發(fā)性化合物的總峰面積和化合物數(shù)量的影響Fig.2 Effect of different sample sizes on total peak area and compound number of volatile compounds in pomegranate

當(dāng)石榴酒樣品量分別為 3、4、5 mL 時(shí)，SPME 萃取的揮發(fā)性化合物的峰面積分別為 13.7×108、16.4×108、253.1×108。隨著頂空瓶中石榴酒體積的增多，峰面積逐漸增大。如亨利定律[15]預(yù)測的那樣，頂空瓶中空氣與水的比率對揮發(fā)物濃度起著重要作用。當(dāng)空氣與水的比例減小，濃度增加，GC-MS 出峰信號強(qiáng)度將增大。Alexandre Béné 等[16]通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表證明了空氣/水比例改變，測量的信號高度與寬度（峰面積）也隨之改變，表明頂空瓶中的系統(tǒng)遵循亨利定律。然而，當(dāng)瓶中體積由5 mL 繼續(xù)增加到7 mL 時(shí)，SPME 的萃取纖維在吸附足夠的化合物后達(dá)到一定的飽和，而頂空瓶中40 ℃的恒溫使得解析速度增大，造成萃取纖維吸附的化合物減少，峰面積減少。由圖2 看出當(dāng)樣品量低于或者超過5 mL 時(shí)，酯類和醇類物質(zhì)的峰面積大小呈現(xiàn)先增加后減小變化，因此，選擇5 mL 作為本試驗(yàn)所選的石榴酒樣品量的優(yōu)化結(jié)果。

2.1.3 萃取的時(shí)間對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

萃取時(shí)間是頂空瓶中液相和氣相達(dá)到平衡的時(shí)間，由石榴酒的分配系數(shù)、擴(kuò)散速率、樣品基質(zhì)、樣品體積、萃取涂層厚度等因素決定[17]。所得萃取化合物的峰面積和萃取種類如圖3 所示。

圖3 不同的萃取時(shí)間對石榴酒中揮發(fā)性化合物的總峰面積和化合物數(shù)量的影響Fig.3 Effect of different extraction time on total peak area and compound number of volatile compounds in pomegranate

吸附是一個(gè)過程，短時(shí)間內(nèi)由于頂空瓶中石榴酒揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較高，當(dāng)萃取時(shí)間從20 min 到50 min增加時(shí)，導(dǎo)致萃取纖維對揮發(fā)性物質(zhì)的吸附逐漸增多，峰面積增大，尤其是醇類物質(zhì)的吸附顯著增多，萃取時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)總峰面積卻顯著減少。一般纖維的吸附速度會(huì)隨著頂空瓶中樣品濃度的增大而增大，到達(dá)一定的時(shí)間后，吸附逐漸達(dá)到飽和，達(dá)到最大的吸附濃度。隨著時(shí)間的繼續(xù)延長，40 ℃的溫度使得萃取纖維上吸附的物質(zhì)的解析速度加快，使得吸附的醇類和酯類等物質(zhì)減少，總峰面積也減少至13.6×108。這與張妮[18]在使用SPME 不同的萃取時(shí)間分析萃取櫻桃酒所得到的規(guī)律基本一致。在此試驗(yàn)中選取萃取時(shí)間為50 min 為萃取時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果。

2.1.4 萃取溫度對酒樣中化合物種類與含量分析結(jié)果的影響

所得萃取化合物的峰面積和萃取種類如圖4所示。

圖4 不同的萃取溫度對石榴酒中揮發(fā)性化合物的總峰面積和化合物數(shù)量的影響Fig.4 Effect of different extraction temperatures on total peak area and compound number of volatile compounds in pomegranate

如圖4 所示，萃取溫度從30.0 ℃到45.0 ℃，總峰面積隨著萃取溫度的升高先升高，溫度的升高可以加速石榴酒中揮發(fā)性成分分子的運(yùn)動(dòng)，有利于化合物的揮發(fā)；當(dāng)萃取溫度從45.0 ℃繼續(xù)升高至55.0 ℃時(shí)，峰面積隨著萃取溫度的升高而減小，這可能是因?yàn)槔w維對不同揮發(fā)性化合物之間具有選擇性，對化合物有不同的親和力，而且在吸附的同時(shí)會(huì)發(fā)生解析現(xiàn)象，解析過程是一個(gè)吸熱過程，解析的速率會(huì)隨著溫度的升高加快，當(dāng)萃取纖維的解析速度大于吸附速度時(shí)，會(huì)使得萃取纖維吸附的化合物減少，峰面積就會(huì)減小；不但如此，溫度過高也會(huì)使石榴酒中的物質(zhì)發(fā)生變質(zhì)。Sybille Merkle 等[19]也得出同樣的結(jié)果，提高樣品溫度可以縮短提取時(shí)間，但過高的溫度也會(huì)發(fā)生不良的化學(xué)反應(yīng)反應(yīng)。因此，萃取溫度選擇45.0 ℃更適合石榴酒中揮發(fā)性化合物的提取。

根據(jù)上述試驗(yàn)對萃取纖維、樣品量、萃取時(shí)間、萃取溫度的優(yōu)化，選擇DVB/CAR/PDMS（二乙烯基本/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）涂層的纖維進(jìn)行萃取，測定的最適石榴酒樣品量為取5.0 mL，萃取時(shí)間為50 min，萃取溫度為45 ℃時(shí)，GC-MS 測定的石榴酒中的小分子物質(zhì)種類較多。

2.2 HS-SPME的重現(xiàn)性

采用上述優(yōu)化后的條件對石榴酒進(jìn)行GC-MS 的6 次重復(fù)性測樣，驗(yàn)證使用HS-SPME 的前處理方式對石榴酒中的香氣化合物的重現(xiàn)性，并進(jìn)行半定量分析，得出以下GC-MS 的色譜圖見圖5。

根據(jù)GC-MS 和RI 共同定性出57 種揮發(fā)性化合物，見表1。

圖5 優(yōu)化后超聲波條件的GC-MS 離子色譜圖Fig.5 GC-MS ion chromatogram of optimized ultrasonic conditions

表1 石榴酒原樣中香氣成分定性結(jié)果及定性方法Table 1 Qualitative results and qualitative methods of aroma components in pomegranate wine

續(xù)表1 石榴酒原樣中香氣成分定性結(jié)果及定性方法Continue table 1 Qualitative results and qualitative methods of aroma components in pomegranate wine

由表1 可知，酯類共20 種，主要包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、反式-肉桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯等；醇類14 種，包括乙醇、異丁醇、異戊醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇等；酸類 8種，包括乙酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等；芳香族化合物7 種包括苯乙烯、苯甲醛、苯乙酮、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇，3-苯丙酸乙酯；醛酮類化合物3 種，包括乙醛、3-羥基-2-丁酮、糠醛；其他包含醚類，硫類，酚類共5 種，包括2，4-二叔丁基苯酚等。可以看出，石榴酒中的香氣化合物主要是酯類、醇類、酸類、芳香族化合物和醛酮類物質(zhì)。

其中，酯類化合物是種類和含量最多的一類香氣化合物，是石榴酒中的呈香氣味化合物之一。乙酸乙酯（2 132.091 mg/L）、辛酸乙酯（1 450.774 mg/L）、癸酸乙酯（1 787.210 mg/L）含量最高，尤其是辛酸乙酯（果香味）和癸酸乙酯（果香味），是石榴酒中的特征香氣化合物，為石榴酒提供特定的石榴香味[20]。根據(jù)對每種化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出HS-SPME 的重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本文通過比較2 種萃取纖維PDMS（聚二甲基硅氧烷）、DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）萃取化合物種類和峰面積，最后選取DVB/CAR/PDMS 作為萃取材質(zhì)，此萃取纖維是3 種固定相組合而成的材料，對多數(shù)的揮發(fā)性化合物有較敏感的響應(yīng)。通過比較不同樣品量對石榴酒中香氣化合物的分析，選擇分析的樣品量為5.0 mL，選擇萃取時(shí)間為50 min，萃取溫度為45.0 ℃，在最優(yōu)條件下，選取DVB/CAR/PDMS 材質(zhì)萃取纖維，移取 5 mL 石榴酒，在 45.0 ℃萃取50 min，進(jìn)行GC-MS 分析，定性出57 中化合物，包括酯類、醇類、酸類、芳香族化合物等，且重現(xiàn)性良好。