自噬調節高濃度葡萄糖誘導的人晶狀體上皮細胞上皮間質轉化

馬濟遠，葉 巍，李 吉，裴 瑞，何夢梅，蘇靜波，孫董潔，周其武，周 健

目的：探究自噬水平變化對高糖誘導人晶狀體上皮細胞上皮間質轉化(EMT)的影響及其機制。

方法：人晶狀體上皮細胞(HLE-B3)分為正常對照組(NC組)和高糖處理組(HG組)，分別用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培養12、24、48h，用Western blot檢測上皮間質轉化標志蛋白(E-cadherin、α-SMA)和自噬標志蛋白(LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62)的表達變化，用劃痕實驗觀察細胞的移行能力以明確高糖對晶狀體上皮細胞自噬和EMT的影響。利用雷帕霉素調節自噬水平，將細胞分為正常對照組(NC組)、高糖處理組(HG組)，高糖處理細胞的同時添加DMSO溶劑組(DMSO組)和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素組(RAPA組)，處理細胞24h，用Transwell實驗觀察細胞的移行能力，用Western blot檢測EMT、自噬標志蛋白和TGF-β信號通路蛋白(TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail)的表達。用細胞免疫熒光染色觀察SQSTM1/p62與Smad2/3在細胞內的表達，免疫共沉淀方法檢測細胞中SQSTM1/p62與Smad2/3之間的相互結合。

結果：在高糖刺激后12、24、48h，HG組細胞E-cadherin、LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達逐漸降低(F=67.52、163、206，均P<0.0001)，而α-SMA、SQSTM1/p62蛋白表達增加(F=53.37、302.1，均P<0.0001)，細胞移行也較NC組增加(均P<0.001)，提示高糖刺激后細胞發生EMT，而自噬水平降低；雷帕霉素處理后，與HG組和DMSO組相比，RAPA組LC3 Ⅱ/Ⅰ和E-cadherin蛋白表達水平增加，α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3及Snail蛋白表達降低(均P<0.05)，TGF-β2表達無明顯改變(均P>0.05)，細胞移行被抑制(均P<0.001)，提示雷帕霉素在提高自噬水平的同時下調了TGF-β信號通路分子的表達進而抑制了EMT。細胞免疫熒光染色結果顯示SQSTM1/p62與Smad2/3在胞漿內存在共定位，免疫共沉淀實驗證實了SQSTM1/p62與Smad2/3蛋白相互結合。

結論：高糖可刺激HLE-B3細胞發生EMT，下調細胞的自噬水平；自噬通過SQSTM1/p62與Smad2/3相互作用，改變了TGF-β信號通路中Smad2/3的表達，實現對EMT的調節。

0 引言

白內障是糖尿病患者的眼部常見并發癥之一，其患白內障的風險是普通人的2～5倍，且發生的年齡更早[1]、原因復雜，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在糖尿病白內障的形成中起了重要作用[2-4]。自噬(autophagy)是一種維持細胞穩態，調節細胞信號傳導和促進細胞存活的基本細胞降解機制[5]。越來越多的研究表明自噬與EMT之間密切相關[6]，一方面，細胞依賴……