圓錐角膜的遺傳學研究進展

徐麗妍，楊凱麗，任勝衛

圓錐角膜是一種以角膜擴張、中央區角膜基質變薄、呈圓錐形突起及高度不規則近視散光為特征的角膜擴張性疾病。前期經家系研究、雙生子研究等多種方法證實，該病的發生有明顯的遺傳傾向。隨著分子生物學技術的發展，圓錐角膜的遺傳學研究也逐漸增多，主要包含核基因組、線粒體基因組及表觀遺傳學相關研究，本文就圓錐角膜相關遺傳學研究進展進行綜述。

0 引言

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種以角膜擴張、中央區角膜基質變薄、呈圓錐狀突起為特征的角膜病變[1]，該病通常于青春期發病，病變呈進行性發展，晚期視力嚴重下降，需行角膜移植手術進行治療[2]。目前的研究表明，圓錐角膜的發生有明顯的遺傳傾向，6%～10%的圓錐角膜患者有陽性家族史，患者一級親屬的發病率顯著高于一般人群發病率[3]。此外，Tuft等[4]在18對雙生子圓錐角膜遺傳一致性的研究中發現，同卵雙胞胎較異卵雙胞胎有更高的遺傳一致性，Kriszt等[5]通過家系共分離分析表明圓錐角膜是一種復雜的非孟德爾遺傳病，上述研究均表明圓錐角膜的發生與遺傳因素密切相關。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的研究集中于疾病發生的分子遺傳機制。目前，圓錐角膜相關的分子遺傳學研究逐漸成為了國內外研究的熱點，該病的遺傳學研究主要集中于核基因組相關研究，而線粒體基因組及表觀遺傳相關研究也相繼被報道。本文就圓錐角膜相關的核基因組、線粒體基因組及表觀遺傳研究進行綜述，以期深入了解圓錐角膜的遺傳學基礎及發病機制，為進一步制定有效的預防措施及治療方案提供新的思路。

1 核基因組相關研究

核基因組包含了基因組絕大多數的遺傳信息，其序列變異對疾病的發生有重要影響。研究表明圓錐角膜的發生有明顯的遺傳異質性，多種基因對該病的發生均有重要作用。目前，圓錐角膜核基因組相關的遺傳研究方法主要有全基因組關聯分析、連鎖分析及候選基因分析三種，篩查該病發生的遺傳易感基因及位點可為探討該病發生的遺傳分子機制提供理論依據。

1.1全基因組關聯分析 全基因組關聯研究(genome wide association study，GWAS)是指在全基因組層面上，以基因組中數以百萬計的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)為分子遺傳標記，尋找與疾病相關的遺傳因素的研究方法。該方法在多種疾病的遺傳研究中普遍應用，目前有關圓錐角膜的GWAS研究已經確定了RAB3-GTP酶激動蛋白基因(RAB3 GTPase activating protein catalytic subunit 1，RAB3GAP1)、肝細胞生長因子基因(hepatocyte growth factor，HGF)、賴氨酸氧化酶基因(lysyl oxidase，LOX)與圓錐角膜的發生密切相關。

Li等[6]通過對高加索人群的研究發現RAB3GAP1基因rs4954218位點與圓錐角膜的發生密切相關，提示RAB3GAP1基因參與了該病的發生過程。RAB3GAP1基因編碼RAB3-GTP酶激活蛋白催化亞基，RAB3-GTP酶是Ca2+介導激素和神經遞質胞外分泌的關鍵調節酶。隨后，許多研究者試圖驗證該位點與圓錐角膜發生之間的相關性，發現在不同人群中其結果也不盡相同。在捷克人群中，RAB3GAP1基因rs4954218位點與圓錐角膜的發生明顯相關[7]，而在中國漢族人群中無明顯相關性[8]，不同澳大利亞人群中的研究結果也不一致[9-10]。

表1 連鎖分析定位的圓錐角膜相關基因座

染色體定位研究人群基因1p36.23,8q13.1～q21.11澳大利亞人2p24歐洲人、阿拉伯人、非洲人2q13～q14.3,20p13～p12.2厄瓜多爾人3p14～q13意大利人3p西班牙人4q歐美、西班牙、亞洲人等5q14.3～q21.1高加索人CAST5q21.2意大利人5q31歐美、西班牙、亞洲人等5q31.1～q35.3厄瓜多爾人5q32～33意大利人5p歐美、西班牙、亞洲人等9q21.13意大利人9q22.2意大利人9p西班牙人9q34歐美、西班牙、亞洲人等11p歐美、西班牙、亞洲人等12p歐美、西班牙、亞洲人等13q32厄瓜多爾人DOCK914q歐美、西班牙、亞洲人等14q11.2意大利人14q24.3多種族人群15q15.1意大利人15q22.32～24.2北愛爾蘭人miR-18416q22.3～q23.1芬蘭人16q23.1意大利人17p13巴基斯坦人17q西班牙人18p11.31意大利人20q12澳大利亞人

Burdon等[11]對澳大利亞及美國人群進行了多階段的GWAS研究，結合tag SNPs位點的基因分型分析及Meta分析發現，HGF基因rs3735520(P=9.9×10-7)及rs17501108(P=9.9×10-5)位點與該人群中圓錐角膜發生的關聯度最高。HGF是由間葉細胞產生和分泌的一種抗纖維化因子，在維持角膜上皮細胞正常功能過程中發揮著重要作用。Dudakova等[12]在捷克人群的研究中證實了rs3735520位點與圓錐角膜發生的相關性，而在中國人群及澳大利亞另一人群的研究中并未發現其相關性[8-9]。

Bykhovskaya等[13]通過對高加索人群的GWAS研究發現，LOX基因第四內含子區的rs10519694及rs2956540位點與圓錐角膜的發生有較強的相關性，進一步對該基因外顯子區域檢測發現rs1800449及rs2288393位點與圓錐角膜的發生具有相關性。LOX是一種銅依賴的胺氧化酶，參與介導角膜基質中的膠原纖維和彈性纖維形成共價鍵，對維持角膜生物力學特性有重要作用。隨后的研究發現，rs2956540位點是歐洲人群及中國漢族人群圓錐角膜發生的遺傳風險位點[12，14]，rs1800449位點A等位基因是伊朗人群圓錐角膜發生的風險等位基因[15]。

1.2連鎖分析 連鎖分析是利用連鎖不平衡的原理探討致病基因與某些遺傳標記關系的一種研究方法，該方法通常在單基因疾病的遺傳研究中廣泛應用，復雜疾病的研究中也有部分應用。目前，圓錐角膜的遺傳方式并不明確，盡管大多數圓錐角膜表現為散發，也有研究報道家族性遺傳在圓錐角膜發病過程中有一定作用。家族性的圓錐角膜多數表現為常染色體顯性遺傳，少部分屬于常染色體隱性遺傳。連鎖分析在圓錐角膜發病機制的研究中也有應用，并且已經定位了許多與該病發生相關的基因及位點(表1[16-17])。

Tang等[18]通過全基因組連鎖分析把1個圓錐角膜家系的致病基因位點定位于5q14.3～q21.1。Li等[19]通過連鎖分析發現定位于該區域的鈣蛋白酶抑制蛋白基因(calpastatin，CAST)rs4434401位點與圓錐角膜的發生密切相關。CAST是一種內源性的鈣蛋白酶抑制劑，其與鈣蛋白酶、鈣蛋白酶激活蛋白構成的鈣蛋白酶系統在維持人體多個組織正常功能過程中有重要作用，研究表明鈣蛋白酶系統對維持角膜上皮細胞更新及創傷愈合過程具有重要作用[20]。圓錐角膜患者的角膜上皮發生了改變，CAST可能通過修復損傷的角膜上皮從而參與圓錐角膜的發生發展過程。

Gajecka等[21]通過對18個厄瓜多爾家系多位點的連鎖分析及單倍型分析將圓錐角膜發生的致病基因位點定位于13q32，深入探究發現定位于該區域DOCK9(dedicator of cytokinesis 9)基因的c.2262 A>C突變可能是其中一家系圓錐角膜發生的突變基因位點[22]。DOCK9蛋白可特異性激活細胞周期分裂蛋白42，參與細胞內信號轉導過程。體外實驗研究發現DOCK9基因c.2262 A>C突變會引起該蛋白剪接異常，導致蛋白翻譯提前終止，使得DOCK9蛋白的功能域受損，從而改變了其生物學特性，影響圓錐角膜的發生過程[23]。

Hughes等[24]通過全基因組連鎖分析對1個患有嚴重圓錐角膜和早發性前極性白內障家系進行了調查研究，結果發現該家系的致病位點定位于15q22～q25，進一步探究發現miR-184基因c.57 C>U突變是該家系的致病突變位點。Bykhovskaya等[25]在對1個患有先天性白內障和早發型重度圓錐角膜的家系調查研究中發現miR-184基因c.57 C>U突變在此家系中同樣存在。miRNA-184是一個長為22nt的內源性非編碼RNA，在角膜及晶狀體中呈特異性高表達。研究表明miR-184種子區c.57 C>U突變與家族性圓錐角膜的發生密切相關，而該突變在散發性圓錐角膜患者中未見報道，這提示該突變與合并其他眼部異常的圓錐角膜病例更為相關。

1.3候選基因分析 候選基因分析是指根據對某種疾病或性狀已有的了解，直接從已知或潛在的基因中挑選出可能對該疾病或性狀有影響的候選基因，進而對其進行分析的一種研究策略，通常采用病例-對照設計的研究方法進行。目前，圓錐角膜的發病機制尚不明確，候選基因分析為其病因學研究提供了新的思路。圓錐角膜的候選基因主要包含視覺系統同源框1基因(visual system homebox 1，VSX1)、鋅指蛋白469基因(zinc finger protein 469，ZNF469)、膠原相關基因、氧化應激相關基因及炎癥相關基因等。

VSX1基因是一個調節細胞正常分化及發育的主控基因，在視網膜視錐雙極細胞的分化及正常功能的維持中具有重要作用，研究發現該基因存在多種突變與圓錐角膜的發生密切相關[26]。De Silva等[27]在巴西人群中發現VSX1基因上L68H、R131S、D105E三個非同義突變位點，Guan等[28]對中國散發圓錐角膜患者的研究發現了VSX1基因R131P雜合性突變，Bardak等[29]在土耳其人群中發現了VSX1基因上D144N、D295Y兩個錯義突變位點，Saee-Rad等[30]通過對伊朗人群的研究發現VSX1基因R166W及H244R突變可能是該人群的致病突變位點，De Bonis等[31]在意大利人群中的突變篩查發現VSX1基因G239R 突變與該人群圓錐角膜的發生具有相關性，Paliwal等[32]在印度人群中發現VSX1基因上Q175H突變位點影響了圓錐角膜的發生，Mok等[33]對韓國人群的研究發現了VSX1基因N151S、G160V兩個突變位點。此外，一些研究也表明VSX1基因突變與圓錐角膜的發生無相關性[8，34]，這可能是由于突變在不同種族人群中的分布不同所造成的，需要進一步探討。

ZNF469基因編碼一種鋅指蛋白，該蛋白與體內某些膠原有低度同源性，在膠原纖維形成過程中發揮作用。Vincent等[35]在新西蘭人群中的研究發現ZNF469基因突變可能參與該人群圓錐角膜發生的病理形成過程。Yildiz等[36]通過對土耳其人群的突變篩查研究發現，ZNF469基因編碼區的P873T、Q2188H突變可能與該病的發生密切相關。Yu等[37]在中國漢族人群散發圓錐角膜患者中發現了ZNF469基因上的7個突變位點，表明該基因參與了中國漢族人群圓錐角膜的發生過程。Zhang等[38]研究發現ZNF469基因的突變篩查可能對預防交聯術后并發癥有一定的指導意義。

圓錐角膜的一個主要病理改變是角膜基質變薄，其可能的原因是膠原數量減少或膠原纖維的結構異常造成角膜機械抵抗力降低，從而導致角膜前凸變薄，因此，膠原相關基因被認為可能與圓錐角膜的發生具有相關性。Saravani等[39]在伊朗人群中探討了COL4A3基因多態性與圓錐角膜發生的關系，結果發現rs55703767位點與該人群圓錐角膜的發病密切相關。Sargazi等[40]通過對伊朗人群COL4A4基因多態性的研究發現，rs2228557位點是該人群圓錐角膜發生的遺傳風險位點。而在其他人群的研究中并未發現COL4A3、COL4A4基因與圓錐角膜發生的相關性[41-42]。研究表明，COL5A1基因改變與中央角膜厚度密切相關，Li等[43]研究表明COL5A1基因rs1536482、 rs7044529位點可能通過影響圓錐角膜患者的中央角膜厚度，從而參與了該病的發生過程。目前的研究尚未發現COL4A1、COL4A2、COL8A1及COL8A2基因與圓錐角膜發生相關[44-45]。

研究表明，圓錐角膜患者中存在較高水平的氧化應激損傷，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)是一種抗氧化酶，可參與角膜組織的氧化應激損傷修復過程。Udar等[46]研究表明SOD1基因是圓錐角膜發生的一個候選基因，測序分析發現圓錐角膜患者中存在SOD1基因第二內含子區7bp的缺失，進一步探究發現該缺失可降低患者體內SOD1的表達水平及活性，使得抵御氧化應激的能力減弱，從而導致圓錐角膜的發生。然而，有關SOD1基因與圓錐角膜發生關系的其它研究中并未發現與該病相關的突變或位點[30-31，47]。

目前的研究表明，炎癥可能參與了圓錐角膜的病理形成過程[48]。Kim等[49]通過病例對照研究發現，白細胞介素1β基因(interleukin 1 beta，IL1B)啟動子區rs1143627、rs16944位點與韓國人圓錐角膜的發生密切相關，Milami等[50]發現rs1143627、rs16944位點與日本人圓錐角膜發生具有相關性。Wang等[51]在中國漢族人群中的研究發現白細胞介素1α基因(interleukin 1 alpha，IL1A)rs2071376位點、IL1B基因rs1143627、rs16944位點與該人群圓錐角膜的發生密切相關。Arbab等[52]通過對巴基斯坦人群的研究發現，TNF-α基因啟動子區rs1800629位點A等位基因增加了該人群圓錐角膜的發病風險。

2 線粒體基因組相關研究

線粒體是存在于真核生物細胞內的一種半自主細胞器，處于新陳代謝和生物能量轉換的中心地位。線粒體DNA屬母系遺傳，其序列突變率極高，研究發現線粒體DNA突變對圓錐角膜的發生也有影響[53]。Pathak等[54]通過對印度人群線粒體復合體Ⅰ相關基因的突變篩查發現，圓錐角膜患者中存在較多的基因序列變異，增多的序列變異與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加密切相關，ROS的增加引起了較多的氧化應激損傷，從而導致圓錐角膜的發生。Abu-Amero等[55]在對沙特阿拉伯人線粒體基因組的測序分析中發現了10個線粒體突變位點，其中m.4218 T>A、m.11393 C>T、m.12504 G>A、m.14000 T>A突變位于線粒體復合體Ⅰ相關基因上，m.4381 A>G、m.5567 T>C、m.5664 A>G、m.12178 C>T、m.12308 A>G、m.12310 insA突變位于tRNA相關基因上，同時，該研究小組發現線粒體單倍群H及R增加了沙特阿拉伯人圓錐角膜的發病風險[56]。Hao等[57]研究發現線粒體單倍群與中國漢族人群圓錐角膜的發生沒有相關性，而線粒體DNA的拷貝數與中國漢族人群圓錐角膜的發生密切相關。

3 表觀遺傳相關研究

表觀遺傳學是指在基因組DNA序列不發生改變的情況下，基因的表達發生了可遺傳的改變。其主要通過DNA甲基化、非編碼RNA調控、組蛋白修飾及染色質重塑等形式調控基因的表達，從而影響疾病的發生發展過程。為了探討DNA甲基化在圓錐角膜發生中的作用，Kabza等[58]通過重亞硫酸氫鹽測序的方法對角膜組織樣本進行了檢測，結果發現許多圓錐角膜連鎖的位點均發生了甲基化水平的改變，進一步探究發現Wnt信號通路相關基因甲基化程度的改變可能影響了基因的表達，從而影響了圓錐角膜的發生發展進程。Wang等[59]采用miRNA芯片對27例圓錐角膜上皮組織及26例對照進行了測序分析，結果發現miR-151a-3p、miR-138-5p、miR-146b-5p、miR-194-5p、miR-28-5p、miR-181a-2-3p在圓錐角膜上皮組織中表達下調。Khaled等[60]通過對10例圓錐角膜組織及8例對照的RNA測序分析發現，lnc-WNT4-2∶1、lnc-SCP2-2∶1、lnc-ALDH3A2-2∶1在圓錐角膜組織中表達上調，lnc-BLID-5∶1、MEG3在圓錐角膜組織中表達下調。然而，這些差異表達的非編碼RNA影響該病發生的具體機制尚不清楚，仍需深入探究。

4 小結

綜上所述，圓錐角膜是一種復雜的遺傳異質性疾病，探討其發生的分子遺傳學機制可為研究該病的發病機制、診斷、治療及預后提供一定的幫助。目前，研究者通過全基因組關聯分析、全基因組連鎖分析、候選基因分析等方法已經定位了核基因組中的一些與圓錐角膜發生相關的易感基因及位點，而線粒體基因組及表觀遺傳也發生了改變，但這些位點及改變影響疾病發生的病理機制尚不明確。因此，篩查圓錐角膜發生的分子遺傳學改變，深入探討其致病性病理機制可為該病的診斷及治療提供理論依據。