TLR4在青光眼視神經損傷機制中的作用

李 倩，張立宇，許育新

青光眼是一種以視乳頭萎縮凹陷、視野缺損及視力下降為共同特征的不可逆的致盲性疾病，其視神經損傷的本質為視神經節細胞的凋亡。盡管通過藥物干預和手術控制眼壓可以對青光眼起到一定的治療作用，但如何從根本上阻止青光眼的進一步發展仍處于探索階段。因此，研究青光眼視神經損傷機制，通過阻斷視神經損傷而治療青光眼至關重要。近幾年，免疫機制對青光眼視神經損傷的影響成為研究熱點，本文中主要對Toll樣受體4(TLR4)通過不同免疫通路并與神經膠質細胞相互作用引起青光眼患者視神經損傷進行綜述。

0 引言

青光眼是一組以視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的逐漸凋亡和軸突變性，以及視野的缺損為特點的神經退行性疾病，病理性眼壓升高是其主要危險因素。青光眼是世界性導致人類不可逆失明的主導因素, 其發病率高達2.6%[1-2]。迄今為止，全球40～80歲的青光眼患者約占總人口的3.5%，而青光眼患者的人數至2040年預計將增加到111萬人[3]?，F階段青光眼的治療以傳統的降眼壓和視神經保護藥物以及濾過性手術和激光手術為主要方法[4]。然而，正常眼壓的青光眼患者或者是眼壓控制良好的青光眼患者視神經損傷仍然存在。由此可見，青光眼視神經損傷的機制尚未完全明了。研究青光眼患者視神經損傷的具體機制，通過阻斷或者延緩受損機制從根本上解決視神經損傷的發生尤為重要。免疫應答與神經退行性疾病(例如阿爾茲海默癥、帕金森疾病)息息相關，而Toll樣受體4(TLR4)作為免疫應答中信號轉導的重要部分，其對神經退行性疾病的影響逐漸受到大家的關注[5]。目前，已有多篇報道發現TLR4和神經膠質細胞的激活在阿爾茲海默癥中的病理作用[5-6]，而青光眼作為神經退行性疾病的一種，其視神經損傷機制與TLR4亦密不可分。本文將就TLR4通過免疫作用導致青光眼視神經損傷進行綜述。盡管青光眼在臨床上分為不同類型，但都以高眼壓為其主要的高危因素，導致視神經損傷的機制也大致相同，本文中討論的青光眼視神經損傷指的是所有病理性高眼壓導致的視神經損傷。

1 青光眼視神經損傷的機制

關于青光眼的視神經損傷機制主要有兩種學說，即機械學說和缺血學說。機械學說強調視神經受壓，軸漿流中斷的重要性。缺血學說則強調視神經供血不足，對眼壓耐受性的重要性。目前一般認為青光眼視神經損害的機制是機械壓迫和缺血的共同作用。在高眼壓作用下，視神經纖維和鞏膜相互施壓以致變形,視神經軸突萎縮,軸漿流受阻,影響視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的營養供應,使視神經纖維壞死、溶解、消失[7]。正常眼部血管具有自我調節能力，使血流相對穩定，當視盤灌注壓明顯下降，眼壓升高導致微循環自身調節功能紊亂，通過形成缺血性環境加劇視神經損傷。隨著對各種細微分子的研究逐漸加深，各種機制也隨之被提出。Qu 等[8]通過分析青光眼患者視神經節細胞的凋亡過程，將機制分為通過受體依賴的胱天蛋白酶(caspase)內部途徑和外部途徑以及激發該家族相關分子促進凋亡三個方面。通過該三個方面詳細解釋了神經營養因子缺乏、神經膠質細胞激活、氧化應激、自噬作用、細胞因子、谷氨酸毒性作用和鈣離子作用等機制的具體過程。此外，國內有學者通過宏觀因素和微觀因素來區分作用機制，或者是強調軸突相關機制和神經膠質細胞免疫應答在青光眼中的重要影響[9-10]。Evangelho等[11]從缺氧、缺血、興奮性毒性、視軸傳導和營養障礙多方面總結了視神經損傷的機制。盡管視神經損傷的機制有多種，但均表現為視神經節細胞的死亡。近年來越來越重視青光眼發病與免疫調節存在的相關性[12]。多種機制通過免疫調節導致神經節細胞死亡。例如氧化應激產生的氧化物或者氮化物可通過激活P38MAPK，來激活caspase-3而引起神經節細胞凋亡損傷。而其詳細的免疫炎癥通路皆與TLR4有著密不可分關系。

圖1 TLR4通過 MyDD8 依賴途徑損傷視神經。

2 Toll樣受體

Toll樣受體(toll like receptor,TLR)是一類典型的1型模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)，在天然免疫系統中發揮著重要的作用[13-14]，該家族共有13個成員(TLR1-13)被發現，其中10個與人有關[15]，TLRs又稱為原型模式識別受體(PRRs)，能夠識別危險相關分子模式(DAMP)或病原體相關分子模式(PAMPs)，從受損的組織或微生物中釋放出來[16]。Toll樣受體是一類1 型跨膜蛋白,由胞外區、跨膜區和胞內區3個功能區組成。由于其胞內結構域與白細胞介素1(interleukin-1, IL-1) 受體的細胞內區域類似,又被稱為Toll/IL-1 受體(Toll/interleukin-1 receptor,TIR) 同源結構域[17],起到調節TLR其下游信號轉導通路的作用。

3 TLR4信號通路

作為天然免疫系統的一部分，TLR4通過與脂結合輔助受體MD-2形成復合物來識別細菌細胞表面脂多糖(LPS)，并導致細胞內炎癥信號的產生[18]。TLR4是唯一一個既可以通過髓樣分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MyD88) 依賴信號通路，又可以通過MyD88非依賴信號通路的Toll樣受體[19]。被激活時分別通過誘導活化其下游的IL-1受體相關激酶 (IL-1R associated kinase, I-RAK) 和腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor, TNFR) 相關因子6 (TNFR associated factor 6, TRAF-6), 并進一步激活核轉錄因子 (nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB),參與介導細胞凋亡、炎癥、氧化應激等多種病理生理過程[20-21]。

4 TLR4的信號通路與青光眼

4.1 TLR4與青光眼的關系 TLR4與青光眼的病理機制有關[22-26]，TLR4在人視網膜、虹膜、眼角膜等組織中都有表達。在青光眼患眼中，TLR4表達升高將會導致眼壓升高[27]。青光眼是一種由于眼內高壓所導致神經退行性疾病，而眼壓又受房水循環控制。因此任何引起房水循環阻塞的因素均會形成高眼壓而觸發視神經損傷機制[28]。

4.2 TLR4的MyD88依賴性通路與青光眼 王乾等[29]研究表明青光眼患者中視野損傷嚴重的患者其TLR4和 MyD88的表達遠高于視野輕度損傷的患者，其過程依照TLR4-MyD88的信號傳導?；罨腡LR4通過和細胞內TIRAP即含有TIR結構域的接頭蛋白，相互作用招募MyD88,激活的MyD88招募下游的TRAK1和IRAK4,活化的IRAK募集并激活下游的TRAF6,此時TRAF6通過形成復合物的形式激活下游的TAK1，TAK1活化下游兩條不同途徑，即P38MAPK和NF-κB信號級聯途徑，從而調節各種炎性細胞因子的轉錄。

4.3 通過TLR4-NF-κB途徑影響青光眼視神經損傷 TLR4-NF-κB途徑與視神經節細胞的死亡有關[30-31]。正常情況下，神經節細胞會自身凋亡,但是炎癥因子的增多會誘導細胞過度凋亡[32]。因此通過TLR4-NF-κB誘導更多的炎癥因子產生必然會加重RGC的凋亡。此外,caspase家族在細胞凋亡信號轉導中有著重要的作用，而TLR4-NF-κB的通路下游將誘導激活caspase-8信號通路[24]，在青光眼中，高眼壓的形成會導致TLR4增多，在其通路下激活caspase-8，caspase-8又可以通過兩條途徑誘導激活IL-β導致神經節細胞死亡，即caspase-1依賴途徑(通過調節激活Nod樣受體家族的NLRP1和NLRP3炎癥反應)和caspase-1非依賴途徑。當TLR-4增加,在兩條途徑共同作用下，IL-β前體轉化為IL-β使視神經損傷加重[33]。此外，青光眼患者在缺血的誘導下通過TLR4-NF-κB可使TNF-α、IL-1β、IL-6、Cox-2和MCP-1上調，炎癥反應活躍，損傷視神經[34]。TLR4-NF-κB信號通路與青光眼視神經損傷有著正相關的關系基本成立。然而Dvoriantchikova等[35]研究中發現，通過激活TLR4-NF-κB途徑存在著保護視網膜缺血的作用，病毒表達活性NF-κB可降低RGCs凋亡(圖1)。

4.4 通過TLR4-P38途徑影響青光眼視神經損傷 盡管TLR4-NF-κB是TLR4的主要通路，但TLR4-P38對青光眼視神經損傷的影響也仍存在。該途徑中P38MAPK的激活使細胞分泌更多的IL-1β，借此可促進分泌Hsp60，Hsp60與TLR4結合，通過MEK 3/6激活P38MAPK，誘導小膠質細胞炎癥，這一過程使視網膜的炎癥反應不斷循環加重，使視神經損傷進一步加深[36-37]。在氧化應激機制中，氧化應激產生的氧化物或者氮化物可通過激活P38MAPK，來激活caspase-3而引起神經節細胞凋亡[38]。

圖2 TLR4 通過MyD88非依賴途徑對視神經產生保護作用。

4.5 MyD88非依賴途徑作用機制 MyD88非依賴途徑是通過結合 TRIF的 TLR4實現的，TRIF 活化己結合IKKi的 TBK1，調節IRF-3的活化和核轉位，最終使IFN-β 表達；MYD88非依賴途徑的TLR4信號在橋梁接頭分子 TRAM的作用下，經由 TRIF活化TRAF6也可導致NF-κB活化，進而引起炎癥反應。Halder等[39]實驗表明在誘導視網膜缺血損傷48h前給予胸腺素原α處理完全防止缺血所致的神經節細胞喪失，雙極細胞和光感受器細胞部分存活，其作用原理就是激活TLR4-TRIF-IRF3通路產生保護性基因，抑制TLR4-MyD88-NF-κB途徑所產生的損害基因，該實驗中TRIF以干擾素β(interferon-β,IFN-β)為代表。除此之外，在該通路的下游還將產生IFIT1和IL1RN等保護性分子。Vartania等[40]實驗中證明TLR4-TRIF-IRF3 通路比MyD88-NF-κB和TRIF-NF-κB通路要快和強烈。然而，利用視神經鉗夾傷模型研究TRIF在視神經損傷再生中的作用機制，卻發現敲除TRIF使RGC存活率增高且視神經再生能力增強[41]。因此該通路對青光眼疾病發展的影響還有待進一步研究(圖2)。

5 TLR4與神經膠質細胞相互作用

膠質細胞的激活是多種神經退行性疾病的病理特征,青光眼視神經損傷的發生與神經膠質細胞也有著密不可分的關系。視網膜的炎癥改變主要是依賴于其自身的免疫細胞即神經膠質細胞，其中以小膠質細胞為多，M2型的小膠質細胞主要參與炎癥損傷，對視神經損傷有著重大影響，此外TLR4主要表達也在神經膠質細胞[42]。正常情況下小膠質細胞可以產生神經營養因子和炎癥因子對視神經起營養免疫防御的作用，維持視網膜內環境穩態平衡，當RGCs壞死激發小膠質細胞過度增殖導致內環境紊亂時，破壞血視網膜屏障使神經元壞死加重。神經膠質細胞的增多可誘導TLR4-NF-κB途徑[39,43]，其通過激活NF-κB通路，分泌 IL-6、TNF-α 等促炎性因子，誘導小膠質細胞的遷移、活化，同時使活化的小膠質細胞更多分化成為 M2 型小膠質細胞[44]。另有報道持續高眼壓可引起視神經慢性炎癥反應，這一過程就是小膠質細胞激活及激活后TLR-4的信號通路完成[45]。總而言之，TLR4和神經膠質細胞相互作用相互促進，神經膠質細胞在TLR4的刺激下逐漸增多，通過NO和TNF-α誘導RGC凋亡。而TLR4在神經膠質細胞的作用下,產生更多的炎癥因子誘導視神經節細胞凋亡(圖3)。

6 TLR4作用于小梁網細胞(TM)引起視神經損傷

TLR4除了對視神經節細胞產生直接的損害外還可通過作用于其他組織結構影響視神經細胞的生存。轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)是多種組織纖維化的主要調節因子，通過細胞外基質增加來引起細胞纖維化。而TLR4已被證實在多個組織中可通過信號通路引起細胞纖維化[46]。在通過TLR4基因突變阻斷TGF-β表達的小鼠模型中表明[47]，TLR 4通過纖維連接蛋白串擾來控制轉化生長因子-β信號的表達，引起小梁網纖維化，導致房水引流阻塞，眼壓升高最終使神經節細胞死亡。

圖3 膠質細胞與TLR4共同作用導致視神經損傷的作用機制。

7 展望與討論

由于青光眼對人們的生活帶來了極大的傷害，研究出新的治療方案刻不容緩，因此對于青光眼發病機制和危險因素的研究成為當今時代的熱點，青光眼具有家族聚集性，與年齡、性別、種族都有關系，不同地區青光眼發病的種類也不同，不同基因對疾病易感性不同[48-49]，近幾年發現，免疫反應對青光眼視神經損傷的影響至關重要，隨著科學的發展和進步以及對青光眼視神經損傷機制的研究越加深入，不斷揭示了青光眼視神經損傷與TLR4的免疫調節之間的聯系，阻斷TLR4的信號通路或者抑制神經膠質細胞的激活，可有效減緩青光眼的視神經損傷[50-51]，然而TLR4不同信號通路對青光眼具體的作用機制仍存在疑惑，在MyD88依賴性途徑在中，TLR4-NF-κB在青光眼視神經的損傷中激活caspase家族加速神經節細胞凋亡，釋放多種促炎癥因子的物質，炎癥反應活躍使視神經損傷。然而Dvoriantchikova等[35]卻證實病毒表達活性的TLR4-NF-κB可對視神經節細胞起保護作用，可見該通路的具體影響機制仍存在疑惑。此外TLR4-P38途徑對視神經主要起損傷作用，TLR4-TRIF-IRF3 對青光眼視神經損傷卻起預防性的保護作用，由此可見，盡管都是TLR4介導的免疫通路其不同的下游激活物對視神經的作用卻是相反的，那么在青光眼視神經損害過程中，機體是否存在某些信號物質使保護性通路發揮其最大功效而抑制對視神經起損害作用的途徑？小膠質細胞在正常情況下發揮著營養和免疫防御作用，當視神經細胞病理性死亡時才會過多激活其分化增殖通過與TLR4的相互作用，引起內環境紊亂，加重視神經損傷。如何阻斷視神經壞死對小膠質細胞的影響，使小膠質細胞僅發揮其神經營養和免疫防御的功能而又不表達過多的TLR4？這些TLR4的矛盾存在是否是因為TLR4的基因多樣性，使TLR4發生突變而形成不同的功能。亦或者機體針對TLR4的作用可產生尚未發現的影響因子，對機體各個方面起繼發的調節作用。盡管TLR4對青光眼視神經損傷的機制尚未完全開發，但不可否認的是針對TLR4這一作用靶點可對青光眼的治療起到至關重要的作用。TLR4不同通路之間的平衡如何去調節來治療青光眼成為進一步需要研究的內容。