尿素脫膠對絲素蛋白氣凝膠力學性能的影響

王宗乾， 楊海偉， 周 劍， 李長龍

(1. 安徽工程大學 紡織服裝學院， 安徽 蕪湖 241000； 2. 中山大學 材料科學與工程學院， 廣東 廣州 510275)

絲素蛋白(SF)是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白[1]，在蠶絲中質量分數占70%～80%，具有良好的生物相容性、生物降解性以及優異的力學性能[2-3]。同時SF易于加工和修飾，通過多樣化的制備方法，可獲得多種形態的SF材料，如水凝膠[4]、多孔支架[5]、薄膜[6]、納米纖維[7]、微球[8]、微針[9]等，在組織工程、藥物緩釋系統以及人造皮膚等領域具有廣闊的應用前景。近年來，SF在氣凝膠領域中得到了廣泛的應用。SF氣凝膠是獨立于無機氣凝膠(如SiO2氣凝膠等)和有機聚合物氣凝膠(如間苯二酚甲醛和三聚氰胺甲醛氣凝膠等)材料之外的生物聚合物氣凝膠材料，在傳統氣凝膠材料特性(如超低密度、高比表面積、超高孔隙率、極低的傳熱系數、低光折射率、低介電常數等)[10-12]基礎上，增加了生物降解和生物相容性的優勢[13]，使得SF氣凝膠在生物醫用材料等領域中具有極大的發展潛力[14-15]。

將蠶絲蛋白用于氣凝膠材料的開發，脫膠是極其重要的一步。目前，在SF氣凝膠制備過程中普遍采用碳酸鈉溶液對蠶絲進行脫膠處理[16-18]，但煮沸的碳酸鈉溶液會使SF肽鏈發生嚴重的斷裂[19]，使SF的相對分子質量降低，導致SF氣凝膠的力學性能較差，因此，為改善SF氣凝膠的力學性能，通過向SF溶液中加入交聯劑(如甲基三甲氧基硅烷[20-21]、丁二醇二縮水甘油醚[22]等)制備得到力學性能優異的SF混合氣凝膠。然而，這些合成交聯劑的使用可能損害SF的生物性優勢。相比碳酸鈉脫膠方法，非堿體系的尿素脫膠對SF的損傷較小，經溶解制備的再生SF的黏度和相對分子質量較大，有利于改善再生SF材料的結構和性能[23-24]。Wang等[19]對比分析了尿素、碳酸鈉和強堿性電解水等脫膠方法對SF膜結構和性能的影響，研究結果也表明尿素脫膠對SF的損傷最小，且顯著提高了SF膜的力學性能、熱穩定性和結晶度。

綜上可知，采用非堿體系的尿素脫膠可減少對SF的損傷，提高其相對分子質量，改善SF材料的結構和性能。與目前已報道的加入交聯劑改善SF氣凝膠力學性能的方法相比，尿素脫膠不僅可改善SF氣凝膠的力學性能，還能保證其生物性免受損害。目前關于尿素脫膠對SF氣凝膠力學性能影響的報道較少。為此，本文以尿素脫膠蠶絲為原料制備了SF氣凝膠，并與碳酸鈉脫膠蠶絲制備的氣凝膠進行對比分析，闡述了尿素脫膠對SF氣凝膠力學性能的影響規律與作用機制，以期為高強度SF氣凝膠的制備提供實驗與理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

蠶生絲，安徽青陽縣三方絲綢有限公司；尿素、無水碳酸鈉、無水氯化鈣、無水乙醇，上海阿拉丁試劑有限公司；苦味酸，臺山眾城化工有限公司；胭脂紅，阿達瑪斯試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 SF溶液的制備

根據文獻[23]中尿素和碳酸鈉脫膠工藝分別對蠶生絲進行脫膠，后經苦味酸胭脂紅染色法[25]判定絲膠已被完全除去，脫膠蠶絲可視為絲素蛋白集合體。

分別將尿素、碳酸鈉脫膠后的蠶絲加入氯化鈣、乙醇和水(三者的量比為1∶2∶8)的三元溶劑中，浴比為1∶20，在80 ℃下振蕩溶解2 h。然后將溶解后的絲素蛋白液分別裝入截留分子質量為8～14 ku的透析袋中，在超純水中持續透析3 d，每4 ～ 6 h更換一次水以除去氯化鈣和乙醇，經質量測試法測試透析后絲素蛋白液的質量分數為2.0%。

1.3 SF氣凝膠的制備

將透析后SF溶液的質量分數稀釋至1.4%，然后分別裝入外徑為17 mm，內徑為14 mm的塑料離心管中，在-20 ℃下冷凍15 h，隨后放入LGJ-10型真空冷凍干燥機(北京松原華興科技發展有限公司)中在-50 ℃下干燥48 h，制備得到SF氣凝膠。本文實驗中，分別將尿素和碳酸鈉脫膠蠶絲制備的氣凝膠記為SF-U和SF-S氣凝膠。

1.4 測試方法

1.4.1 密度測試

將圓柱形SF氣凝膠切成長度約為20 mm， 使用數顯卡尺和分析天平測量氣凝膠的尺寸(長度和直徑)和質量，以計算SF氣凝膠的密度[26]。

1.4.2 力學性能測試

采用H10 K-S型萬能材料試驗機(美國錫萊亞太拉斯有限公司)對SF氣凝膠的力學性能進行測試。所有測試的SF氣凝膠均為圓柱體，其直徑和高度分別約為10和20 mm，壓縮速率為1 mm/min，根據得到的應力-應變曲線的斜率計算壓縮模量。各樣品測試5次，取平均值。

1.4.3 微觀形貌觀察

在SF氣凝膠樣品上鍍金處理后，使用S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立公司)在5 kV的加速電壓下觀察SF氣凝膠的微觀形貌。

1.4.4 化學結構測試

采用Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR， 美國鉑金埃爾默公司)對SF氣凝膠的化學結構進行測試。測試條件為：分辨率4 cm-1，掃描次數32，波數范圍4 000 ～ 500 cm-1。

為定量分析SF氣凝膠中二級結構的變化，選取酰胺Ⅰ帶對應的 1 700～1 600 cm-1波數范圍的紅外光譜，并用Origin 9.0軟件通過Savitzky-Golay法，采用15點三次函數對紅外光譜曲線進行平滑處理并求其二階導數光譜，通過二階導數光譜在1 700～1 600 cm-1波數范圍內尋找各種類型二級結構的峰位，并結合Origin中高斯(Gaussian)分峰擬合方法得到各二級結構子峰的分布和強度，根據各子峰峰面積即可統計SF氣凝膠中二級結構的類型和相對含量[27]。

1.4.5 結晶結構測試

采用D8系列X射線衍射儀(XRD，德國布魯克公司)對SF氣凝膠的結晶結構進行測試，測試條件為：Cukα靶(波長為0.154 nm)，電壓40 kV，電流 30 mA，衍射角度掃描范圍5° ～ 40°，掃描步長0.02°，掃描速度2(°)/min。此外，基于SF氣凝膠的XRD譜圖，通過Herman方法[28]計算SF氣凝膠的結晶度。

2 結果與討論

2.1 SF氣凝膠的力學性能分析

本文通過計算得到尿素脫膠蠶絲和碳酸鈉脫膠蠶絲制備的SF-U和SF-S氣凝膠的密度分別為(13.43±0.77)和(12.76±1.01) mg/cm3，其對應的力學性能測試結果如圖1所示?？芍?，2種氣凝膠的應力-應變曲線均呈現3個階段，分別為低應變下的線性彈性區間，中等應變下的非線性塑性變形平臺以及高應變下應力急劇增加區。同時，依據應力-應變曲線計算壓縮強度與壓縮模量發現，相較于SF-S氣凝膠，SF-U氣凝膠的抗壓縮強度與抗壓縮模量均有顯著提升，當壓縮形變為70% 時，SF-U 氣凝膠的壓縮強度與壓縮模量可分別達到(32.36±2.35)和(119.31±8.93) kPa，表明采用非堿體系的尿素脫膠有助于提升SF氣凝膠的力學性能。進一步通過簡單的壓縮測試可以發現， SF-U氣凝膠可支撐2枚一元硬幣重量且不被壓縮變形，而SF-S氣凝膠經相同規格的1枚硬幣壓縮時，已出現明顯的壓縮變形，再次表明SF-U氣凝膠的抗壓縮性能明顯優于SF-S氣凝膠。

圖1 2種SF氣凝膠的壓縮應力-應變曲線Fig.1 Compressive stress-strain curve of two different SF aerogels

2.2 SF氣凝膠的微觀形貌分析

圖2示出SF-U和SF-S氣凝膠材料的微觀掃描電鏡照片。可以看出，二者具有顯著差異：SF-U氣凝膠具有穩定的立體骨架結構，整個氣凝膠結構中均勻分布著尺寸在幾十到幾百微米區間的空洞；SF-S氣凝膠結構混雜，骨架結構不完整，且以纖細化的薄片層堆砌結構為主，孔洞尺寸與分布也不均一，推測與冷凍干燥過程中氣凝膠發生的變形坍塌有關[29]。綜上可知，穩定的立體骨架結構是SF-U氣凝膠具有較高力學性能的重要緣由。

圖2 SF-U和SF-S氣凝膠的掃描電鏡照片(×100)Fig.2 SEM images of SF-U (a) and SF-S (b) aerogel (×100)

2.3 SF氣凝膠的二級結構分析

采用FT-IR對SF氣凝膠的二級結構進行分析，結果如圖3所示。可知，紅外譜圖中1 700 ～ 1 600、 1 600 ～ 1 500 cm-1波段分別對應于絲素蛋白骨架的酰胺I帶、酰胺II帶特征吸收峰。進一步地，2種SF氣凝膠在1 516和1 530 cm-1處都出現了特征吸收峰，分別對應酰胺II中的 β-折疊和無規則卷曲結構[18]。在酰胺I帶中，SF-S氣凝膠在1 644 cm-1處的特征峰對應為無規則卷曲結構，而在SF-U氣凝膠中則轉移至1 638 cm-1處，這是由于SF中的無規則卷曲構象向 β-折疊構象轉變所致[30-31]。

圖3 SF-U和SF-S氣凝膠的FT-IR光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of SF-U and SF-S aerogels

文獻[32-33]表明蛋白質的二級結構可用酰胺I帶表征，因此，為定量地分析SF氣凝膠中二級結構的變化，對酰胺I帶的紅外光譜圖進行高斯分峰擬合，結果如圖4所示，并依據各子峰的峰面積統計各類二級結構的相對含量如表1所示。其中，1 655 ～ 1 642和1 690 ～ 1 670 cm-1處代表無規卷曲構象(I)，1662～ 1 656 cm-1處代表 α-螺旋構象(II)，1 640 ～ 1 615 cm-1處代表 β-折疊構象(III)[34-35]。

圖4 SF-U和SF-S氣凝膠的高斯分峰擬合曲線Fig.4 Gaussian peak fitting of SF-U (a) and SF-S (b) aerogel

表1 SF氣凝膠二級結構擬合結果Tab.1 Fitting results of secondary structures in SF aerogel

由表1可知：SF-U、SF-S氣凝膠中各類二級結構的含量表現出較大差異；相較于傳統的SF-S氣凝膠，SF-U氣凝膠的無規則卷曲結構含量明顯降低，α-螺旋與 β-折疊二級結構相對含量提高，其中β-折疊結構相對含量超過50%，已成為相對含量占據絕對優勢的二級結構。

文獻[36]還表明，β-折疊結構及其含量是決定SF材料力學性能的關鍵因素，SF-U氣凝膠中 β-折疊結構的含量高于SF-S氣凝膠，使得其力學性能得到改善。在前期研究中已發現，尿素脫膠對SF的損傷較小[23-24]，經溶解制備的SF相對分子質量較大，溶液中SF分子在冷凍過程中易發生聚集，進而引起其構象從無規則卷曲轉變為 β-折疊構象[37]，導致 SF-U 氣凝膠中 β-折疊構象的含量較高；而碳酸鈉脫膠對SF損傷較大，經溶解制備的SF相對分子質量較小，SF較低的相對分子質量影響了其構象由無規則卷曲向 β-折疊的轉變。

2.4 SF氣凝膠的結晶結構分析

圖5示出SF-U、SF-S氣凝膠的XRD譜圖?？梢钥闯?，SF-U和SF-S氣凝膠均在 2θ為9.1°和22.5°處出現了特征衍射峰，分別對應silk II 和silk I 構象[38-39]。此外，SF-U氣凝膠在2θ為20.3°附近出現了比較尖銳的特征衍射峰，為典型的silk II 構象衍射信號[38]，采用Herman法計算SF-U氣凝膠的結晶度為49.33%。SF-S氣凝膠在2θ為19.7°附近出現了較寬的衍射峰，該峰位與silk I 構象相對應[40]，經計算其結晶度為38.54%。這主要是因為尿素降低了脫膠對SF肽鏈的損傷，溶解制備的SF相對分子質量較高，在水溶液中易于聚集，經冷凍和冷凍干燥后形成了規整的silk II 結構(即 β-折疊)可提高SF氣凝膠的結晶度，這與SF氣凝膠二極結構的FT-IR分析結果相一致。綜上，SF-U 氣凝膠具有更為顯著的silk II 構象特征，且結晶度較高，使得分子具有高水平的取向，阻礙了分子鏈的滑動，從而改善了SF-U氣凝膠的壓縮性能。

圖5 SF-U和SF-S氣凝膠的XRD譜圖Fig.5 XRD spectra of SF-U and SF-S aerogels

3 結 論

1) 基于尿素脫膠蠶絲，絲素蛋白(SF)的溶解、透析、稀釋以及冷凍干燥等工藝制備得到密度為(13.43±0.77) mg/cm3的SF氣凝膠。

2) 非堿性體系的尿素脫膠減少了脫膠對SF的損傷，溶解制備的SF相對分子質量較大，在溶液中易于聚集，經冷凍干燥后形成了穩定的立體骨架結構，且SF氣凝膠二級結構中的無規則卷曲結構向 β-折疊結構轉變，具有典型的silk II構象，結晶度提高，進而改善了SF氣凝膠的力學性能。

3) 壓縮形變為70% 時，尿素脫膠制備的SF氣凝膠的壓縮強度和壓縮模量分別為(32.36±2.35)和(119.31 ± 8.93) kPa，遠高于碳酸鈉脫膠制備的SF氣凝膠。