一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS染料的脫色

徐紅云， 于 存， 蘇 幫

(1. 貴州民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2. 貴州大學(xué) 林學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

染色廢水具有色度大、成分復(fù)雜、有機(jī)物含量高等特點(diǎn)，如果不經(jīng)處理就排放到環(huán)境中會(huì)造成污染[1-3]。目前紡織染色廢水處理方法包括物理、化學(xué)和生物法等[4-5]，其中以物理和化學(xué)法應(yīng)用較多。常規(guī)的染色廢水處理方法多存在處理成本高、操作難度大、易產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)。其中，利用生物進(jìn)行染料廢水處理避免了二次污染，且具有環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使得利用生物進(jìn)行染料廢水治理受到廣泛關(guān)注和研究[6]。

目前，可用于治理染色廢水的生物類群包括真菌、細(xì)菌、放線菌和藻類等。其中以真菌和細(xì)菌對(duì)染料脫色的相關(guān)研究最為廣泛。目前為止，已發(fā)現(xiàn)脫色真菌的種類達(dá)幾十種，涉及米根酶(Rhizopusoryzae)、煙曲霉(Aspergillusfunigatus)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、白腐真菌等，其中以白腐真菌研究最為廣泛[7]。自 1980年發(fā)現(xiàn)黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)能夠通過產(chǎn)生漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和菌絲吸附作用對(duì)染料脫色以來[8]，關(guān)于可對(duì)染料脫色的白腐真菌種類的篩選、脫色條件的優(yōu)化、脫色機(jī)制等方面的研究有很多[9-11]。以往研究顯示，白腐真菌對(duì)染料的脫色受多種因素的影響，包括白腐真菌分泌降解酶的能力，染料的結(jié)構(gòu)，脫色過程中所處環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)元素種類及濃度，金屬離子、酸堿度和溫度等[12-14]，因此，篩選脫色較強(qiáng)的白腐真菌菌株，并對(duì)其脫色條件進(jìn)行優(yōu)化對(duì)廢水染料的生物脫色具有重要意義。

一色齒毛菌(Cerrenaunicolor)是一種廣泛分布于世界范圍內(nèi)的白腐真菌。已有研究顯示，一色齒毛菌對(duì)多種染料具有較強(qiáng)的脫色能力[10,12]。本文利用一色齒毛菌對(duì)5種直接染料進(jìn)行脫色效果的檢測(cè)；同時(shí)對(duì)一色齒毛菌脫色直接大紅4BS的脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為白腐真菌在直接染料廢水治理方面的應(yīng)用研究提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

菌株：一色齒毛菌，自制，菌絲體保存于4 ℃冰箱中。

染料：直接深藍(lán)L-3RB、直接嫩黃3GN、直接金黃2GL、直接耐曬黑G、直接大紅4BS，生工生物工程(上海)股份有限公司。

試劑：果糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、瓊脂粉、硝酸銨(NH4NO3)、硝酸鈉(NaNO3)、硫酸銨((NH4)2SO4)、尿素、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鐵(FeCl3·6H2O)、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、硫酸錳(MnSO4)、硫酸銅(CuSO4·7H2O)等，均為分析純，貴州格瑞恩生物科技有限公司。

儀器：722型紫外-可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)；DH124D型恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)；Q200型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；PHS-3C型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 一色齒毛菌對(duì)直接染料的脫色試驗(yàn)

首先配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯質(zhì)量濃度為 20 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度為 20 g/L，瓊脂質(zhì)量濃度為15 g/L，蒸餾水定容至1 L。在配制過程中，分別向培養(yǎng)基中加入染料質(zhì)量濃度為50 mg/L的直接耐曬黑G、直接深藍(lán)L-3RB、直接大紅4BS、直接嫩黃3GN、直接金黃2GL作為染料固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌后，倒入90 mm培養(yǎng)皿中，分別在不同染料的培養(yǎng)基中接入新活化的一色齒毛菌菌餅(直徑為1 cm)，于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。以不接入菌餅的培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)20 d后比較培養(yǎng)基顏色變化，檢測(cè)一色齒毛菌對(duì)直接染料的脫色能力。

1.2.2 培養(yǎng)條件對(duì)一色齒毛菌脫色效果影響

以直接大紅4BS為脫色目標(biāo)物，首先配制液體染料發(fā)酵培養(yǎng)基，其中馬鈴薯質(zhì)量濃度為20 g/L，改變培養(yǎng)基碳源種類(分別以20 g/L的果糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉作為碳源，以不添加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照)、氮源種類(分別以1 g/L的硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素、蛋白胨作為氮源制作培養(yǎng)基，以不添加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照)、pH值(分別調(diào)整培養(yǎng)基的pH值為3、5、7、9、11，以不調(diào)整pH值的培養(yǎng)基作為對(duì)照)、金屬離子(分別添加濃度為1 mmol/L的硫酸鎂、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鋅、硫酸錳、硫酸銅制作培養(yǎng)基，以不添加金屬離子的培養(yǎng)基作為對(duì)照)、染料質(zhì)量濃度(分別調(diào)整培養(yǎng)基中染料最終質(zhì)量濃度為10、50、100、250 mg/L)，并用蒸餾水定容至1 L。取3片直徑為1 cm活化后的菌絲接種至不同培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)13 d后，利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液吸光度，考察不同培養(yǎng)條件對(duì)一色齒毛菌脫色效果的影響。

1.2.3 脫色正交試驗(yàn)優(yōu)化

以直接大紅4BS為脫色目標(biāo)物，按照表1正交試驗(yàn)配方配制液體染料發(fā)酵培養(yǎng)基，并接入一色齒毛菌菌餅，于28 ℃培養(yǎng)13 d后，測(cè)定發(fā)酵液吸光度并計(jì)算脫色率。

表1 脫色正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 染料吸光度測(cè)定和染料脫色率的計(jì)算

在100 mL三角燒瓶中裝入50 mL不同處理?xiàng)l件下的液體染料發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌后，分別向每個(gè)三角燒瓶中接入菌餅3片(直徑為 1 cm)后，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)13 d，在培養(yǎng)的第1、4、7、10、13天吸取2 mL發(fā)酵液，經(jīng) 10 000 r/min 離心5 min后，吸取1 mL上清液，在直接大紅4BS的最大吸收波長(zhǎng)λmax為507 nm處，利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。脫色率計(jì)算公式為

R=(A1-A0)/A0×100%

式中：R為脫色率，%；A0、A1分別為脫色前后染料發(fā)酵液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 一色齒毛菌對(duì)不同染料的脫色效果

圖1示出一色齒毛菌對(duì)直接深藍(lán)L-3RB、直接嫩黃3GN、直接金黃2GL、直接耐曬黑G、直接大紅4BS這5種直接染料在固體條件下的脫色結(jié)果。可以看出，一色齒毛菌可不同程度地對(duì)5種直接染料進(jìn)行脫色，其中直接大紅4BS脫色前后的顏色變化最為明顯。分析一色齒毛菌對(duì)不同直接染料脫色效果不同的主要原因是與染料的成分和結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)[15]。在接下來的研究中選擇更易被一色齒毛菌脫色的直接大紅4BS作為后續(xù)脫色效果的試驗(yàn)對(duì)象。

圖1 一色齒毛菌對(duì)5種直接染料的脫色效果Fig.1 Decolorization of 5 kinds of direct dyes by Cerrena unicolor

圖2 不同碳源條件下一色齒毛菌對(duì)直接 大紅4BS的脫色率Fig.2 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different carbon sources by Cerrena unicolor

2.2 碳源種類對(duì)脫色效果的影響

不同碳源種類對(duì)一色齒毛菌脫色直接大紅4BS的脫色率測(cè)試結(jié)果如圖2所示。可以看出，與對(duì)照樣相比，添加碳源均可促進(jìn)一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。其中以葡萄糖為碳源的試樣脫色效果最佳，蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖等其他碳源對(duì)一色齒毛菌脫色的促進(jìn)效果則依次減弱，表明添加碳源對(duì)一色齒毛菌的脫色具有促進(jìn)作用，且不同碳源對(duì)脫色促進(jìn)作用不同。其原因可能是碳源的加入促進(jìn)了白腐菌降解酶的分泌，或碳源的加入對(duì)菌絲的促進(jìn)作用進(jìn)而增加了菌絲對(duì)染料的吸附[8,10]。

2.3 氮源種類對(duì)脫色效果的影響

不同氮源種類對(duì)一色齒毛菌脫色直接大紅4BS脫色測(cè)試結(jié)果如圖3所示。可以看出，與不添加氮源的對(duì)照組試樣相比，所添加的幾種氮源均有利于一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。其中蛋白胨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨作為氮源，對(duì)一色齒毛菌脫色的促進(jìn)作用依次增強(qiáng)，尤其是硫酸銨更有利于一色齒毛菌的脫色。原因是添加適宜的氮源可促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)和白腐菌降解酶活性的提高[10]，進(jìn)而加強(qiáng)一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。

圖3 不同氮源條件下一色齒毛菌對(duì)直 接大紅4BS的脫色率Fig.3 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different nitrogen sources by Cerrena unicolor

2.4 金屬離子種類對(duì)脫色效果的影響

金屬離子對(duì)一色齒毛菌脫色直接大紅4BS脫色率測(cè)試結(jié)果如圖4所示。可以看出：與不添加金屬離子相比，添加硫酸鎂、硫酸銅、氯化鐵、硫酸鋅、氯化鈣均可促進(jìn)一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色，其中以添加硫酸鎂對(duì)一色齒毛菌脫色的促進(jìn)效果最明顯；而添加硫酸錳則不利于一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。原因是金屬離子對(duì)白腐菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生降解酶具有一定影響[10]，添加適宜的金屬離子可促進(jìn)白腐菌降解酶的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)脫色效果。

圖4 不同金屬離子條件下一色齒毛菌對(duì) 直接大紅4BS的脫色率Fig.4 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different metal ions by Cerrena unicolor

2.5 pH值對(duì)脫色效果的影響

不同pH值條件下，一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH值條件下一色齒毛菌對(duì) 直接大紅4BS的脫色率Fig.5 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different pH values by Cerrena unicolor

由圖5可以看出：pH值為7時(shí)更利于一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色；而過酸和過堿條件均不利于一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。當(dāng)pH值由7逐漸降低時(shí)，染料脫色率隨之降低；當(dāng)pH值為3時(shí)，脫色率維持在極低的水平；當(dāng)pH值由7逐漸增加時(shí)，一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色亦逐漸降低；當(dāng)pH值為11時(shí)，脫色率亦維持在較低的水平。這是因?yàn)榘赘置诮到饷甘躳H值條件的影響，過酸或過堿條件均不利于白腐菌降解酶的產(chǎn)生。本文研究中，適宜的脫色pH值范圍與一色齒毛菌分泌降解酶的適宜pH值規(guī)律相近[10]。

2.6 染料質(zhì)量濃度對(duì)脫色效果的影響

白腐菌對(duì)染料的脫色主要通過其分泌降解酶的降解作用和菌絲吸附作用共同完成。其中，白腐菌降解酶在染料脫色過程中，當(dāng)染料質(zhì)量濃度較高時(shí)，過高質(zhì)量濃度的染料形成相對(duì)更多的染料大分子空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而會(huì)阻礙染料與降解酶分子活性中心的結(jié)合。而菌絲在吸附染料達(dá)到飽和后，就不能繼續(xù)吸附更多的染料。此外，人工合成染料通常具有毒性，較高濃度的染料產(chǎn)生更高的毒性，會(huì)對(duì)白腐菌菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響[12]，因此，研究白腐菌對(duì)特定染料的降解范圍可為白腐菌降解染料的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。染料質(zhì)量濃度對(duì)一色齒毛菌脫色直接大紅4BS的影響結(jié)果如圖6所示。可以看出：當(dāng)染料質(zhì)量濃度在較低水平(10 mg/L)時(shí)，脫色率維持在較高的水平；隨染料質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，脫色率會(huì)逐漸下降；當(dāng)染料質(zhì)量濃度為250 mg/L時(shí)，脫色率下降明顯，維持在較低的水平；因此，利用一色齒毛菌降解直接大紅4BS的質(zhì)量濃度范圍不宜過高，以免降低脫色效率。

圖6 不同染料質(zhì)量濃度下一色齒毛菌 對(duì)直接大紅4BS的脫色率Fig.6 Decolorization of Direct Scarlet 4BS under different dye concentration conditions by Cerrena unicolor

2.7 一色齒毛菌的脫色條件優(yōu)化分析

一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS脫色的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表2。可知，9個(gè)試驗(yàn)組合條件下染料脫色率范圍在74.37%～89.12%。通過比較正交試驗(yàn)各因素不同水平均脫色率均值大小可知，最優(yōu)條件為A2、B2、C3、D1，即：葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L、硫酸銨質(zhì)量濃度1 g/L、硫酸鎂濃度1.5 mmol/L、50 mL染料發(fā)酵液中接菌量2片(直徑為1 cm)。為分析 4個(gè)因素對(duì)一色齒毛菌脫色影響的程度大小，進(jìn)行了極差R分析，由表2中R值結(jié)果可知，不同因素對(duì)脫色影響程度的順序?yàn)椋航泳?硫酸鎂濃度>硫酸銨質(zhì)量濃度>葡萄糖質(zhì)量濃度。

表2 一色齒毛菌脫色直接大紅4BS正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimization of decolorizing condition of Direct Scarlet 4BS by Cerrena unicolor by orthogonal test

2.8 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

在2.7節(jié)優(yōu)化條件及1.1節(jié)液體染料發(fā)酵培養(yǎng)基條件下(優(yōu)化前)進(jìn)行染料的脫色，結(jié)果如圖7 所示。可以看出：優(yōu)化條件下的染料脫色率明顯高于優(yōu)化前的脫色率；當(dāng)脫色至13 d時(shí)，一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色率達(dá)到92.00%，高于正交試驗(yàn)優(yōu)化組合中最高脫色率(89.12%)，進(jìn)而驗(yàn)證了正交試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的正確性。與優(yōu)化前第13天脫色率相比，優(yōu)化后第13 天的脫色率提高了50.82%。

圖7 脫色條件優(yōu)化前后一色齒毛菌對(duì) 直接大紅4BS的脫色率Fig.7 Decolorization rate of Direct Scarlet 4BS by Cerrena unicolor before and after decolorization

3 結(jié) 論

1)一色齒毛菌對(duì)直接深藍(lán)L-3RB、直接嫩黃3GN、直接金黃2GL、直接耐曬黑G、直接大紅4BS這 5種直接染料均有一定的脫色效果，其中對(duì)直接大紅4BS的脫色效果更為明顯。

2)一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS單因素條件下的脫色結(jié)果顯示，以葡萄糖作為碳源，硫酸銨作為氮源，硫酸鎂作為金屬離子，pH值為中性的處理?xiàng)l件更利于一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS的脫色。染料質(zhì)量濃度對(duì)脫色效果的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨染料質(zhì)量濃度的升高，染料脫色率逐漸下降，一色齒毛菌脫色直接大紅4BS的質(zhì)量濃度不宜超過250 mg/L。

3)一色齒毛菌對(duì)直接大紅4BS脫色的優(yōu)化條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度 1.0 g/L，硫酸鎂濃度1.5 mmol/L，50 mL染料發(fā)酵液中接菌量2片(直徑為1 cm)。在該條件下，脫色13 d時(shí)脫色率與優(yōu)化前相比提高了50.82%。