miR-145靶向PDCD4在缺血性腦卒中的作用機制

劉宏偉，姚建輝，劉鵬軍，李衛民

（1）榆林市第一醫院急診科；2）重癥醫學科，陜西榆林 719000）

缺血性腦卒中是急重癥醫學科室常見病之一，是非創傷性殘疾的主要原因，也是世界第二大死亡原因[1]。缺血性腦卒中由于腦的供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導致的腦組織壞死性疾病，可造成患者永久喪失勞動力，嚴重影響人們的生活和健康。研究發現，細胞因子介導大量炎性因子釋放造成神經干細胞炎性反應以及非正常凋亡是促進缺血性腦卒中發展的主要原因之一[2]。因此，深入探討調控神經干細胞炎性反應和細胞凋亡的分子機制，是有效緩解缺血性腦卒中進展的主要手段。研究表明，miRNA參與調控缺血性腦卒中引起的神經干細胞凋亡和炎性反應[3]，其中，miR-145在缺血性腦卒中后表達下調，高表達時能抑制神經干細胞凋亡緩解缺血性腦卒中的進展[4]。程序性細胞死亡因子4（Programmed cell death 4；PDCD4）在缺血性腦卒中后高表達，并加重缺血性腦卒中的損傷程度[5]，同時PDCD4在近年研究中發現能參與調控細胞凋亡及炎性反應[6]。但目前尚無文獻報道miR-145通過調控PDCD4參與缺血性腦卒中引起的神經干細胞炎性反應和細胞凋亡。因此，本研究將重點探討miR-145靶向作用PDCD4調控缺血性腦卒中引起的NE-4C細胞炎性反應和細胞凋亡，為今后臨床治療缺血性腦卒中的研究提供一定參考方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

小鼠神經干細胞NE-4C（貨 號：BNCC341769）購買于BeNaCulture，胎牛血清（貨號：10270106）和DMEM（貨號；10566024）培養基購買于Gibco；SYBR Green qPCR（貨號：K0252）、First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：K1612）和凋亡試劑盒（貨號：V13242）均購買于Thermo Fisher公 司；miR-145 mimics/ inhibitor由Gene Pharma公司構建；pmirGLO luciferase Target Expression Vector和雙熒光素酶報告基因測試盒（貨號：SLDL-100）購買于PuFei生物；免疫印跡一抗（Anti-PDCD4antibody貨號：ab51495）及二抗均購自Abcam公司。

1.2 細胞培養轉染及處理

將小鼠神經干細胞NE-4C細胞在37℃、5%CO2條件下于10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。當NE-4C細胞處于對數生長期時用濃度20μM的H2O2處理NE-4C細胞后，收集經處理過的細胞，根據LipofectamineTM2000 Kit轉染miR-145 mimics、sh-PDCD4、miR-145inhibitor，48 h后觀察轉染效果。

1.3 RT-qPCR檢測miRNAs、IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達

離心收集各組細胞，采用RNA提取試劑盒提取各組經處理過細胞的總RNA，在測定濃度后，反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，分別以U6和GAPDH為內參，根據SYBR Green qPCR試劑盒說明書，以U6和GAPDH為內參，檢測各組NE-4C細胞目標miRNA或mRNA的表達水平進行擴增，以95℃5 min，94℃30 s，60 ℃30 s為反應條件進行40個循環，采用公式2-△△Ct計算相關基因表達量。其中引物序列，見表1。

1.4 Western blot檢測PDCD4蛋白的表達

收集經處理過的細胞，裂解液提取總蛋白后Bio-Rad DC蛋白質測定法檢測純度及濃度，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白條帶，半干法轉膜將條帶轉印到PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用以下稀釋過的一抗（Anti-PDCD4antibody 1:1 500）在4℃條件下過夜孵育；棄去一抗洗膜緩沖液洗滌后，加入稀釋好的二抗（1:2 000）避光1h后采用顯色液進行顯色，凝膠成像儀曝光觀察并拍照，最后采用Image J對蛋白條帶灰度進行定量分析。

1.5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR－145與PDCD4的調控關系

將含有PDCD4 3'UTR野生型（WT）或突變體（MUT）片段與miR145結合位點的序列插入pmir-GLO luciferase Target Expression Vector中構建mirGLO-PDCD4-WT/MUT熒光素酶報告載體，使用Lipofectamine將載體和對照組轉染HEK 293T細胞，轉染48 h后，雙熒光素酶報告基因測試盒檢測熒光素酶活性。

1.6 Annexin-V-FITC實驗檢測NE-4C細胞凋亡水平

收集處于對數生長期經處理的NE-4C細胞，PBS清洗3次，離心棄上清，將NE-4C細胞與預冷的1×結合緩沖液、5μL Annexin V-FITC和5μL PI均勻混合后避光孵育10 min，上機檢測NE-4C細胞凋亡水平。

1.7 統計學處理

采用SPSS和GraphPad Prism軟件對實驗結果進行分析和繪圖；以（）表示，其中兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。數據以P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for PCR

2 結果

2.1 H2O2 處理促進NE-4C細胞凋亡和產生炎性反應

RT-qPCR檢測結果表明，使用H2O2處理后，IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達水平高于未處理組（P＜0.01），見圖1A。流式細胞儀檢測結果表明，與對照組相比，H2O2處理促進了NE-4C細胞凋亡水平（P＜0.01），見圖1B。以上結果可知，H2O2處理能促進NE-4C細胞凋亡和產生炎性反應。

圖1 H2O2 處理促進NE-4C細胞凋亡和產生炎性反應Fig.1 H2O2 treatment promotes apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

2.2 H2O2 處理下調NE-4C細胞中miR-145的表達

RT-qPCR結果表明，與未處理組相比，在H2O2處理的NE-4C細胞中miR-19a、miR-130、miR-145以及miR-224-3p表達均下調（P＜0.05），其中miR-145表達水平最低（P＜0.01）。以上結果表明，異常低表達的miR-145可能與NE-4C細胞凋亡和炎性反應有關，見圖2。

圖2 H2O2 處理下調NE-4C細胞中miR-145的表達Fig.2 H2O2 treatment down-regulates the expression of miR-145 in NE-4C cells

2.3 過表達miR-145抑制H2O2 誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應

RT-qPCR結果表明，與NC和H2O2處理組相比，過表達miR-145顯著上調了NE-4C細胞miR-145的表達水平（P＜0.01），圖3A；同時RT-qPCR檢測結果發現，與NC和H2O2處理組相比相比，過表達miR-145并采用H2O2處理后顯著下調了IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達（P＜0.01），圖3B；而只采用H2O2處理與NC組差異無統計學意義。流細胞儀檢測結果表明，與NC和H2O處理2組相比，過表達miR-145并采用H2O2處理顯著抑制了H2O2誘導的NE-4C細胞凋亡（P＜0.01），圖3C。此實驗結果可知，過表達miR-145緩解H2O2誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應。

2.4 miR-145靶向下調PDCD4的表達水平

通 過 Microrna（www.microrna.org/microrna/home.do）數據庫的預測結果發現，PDCD4是miR-145的潛在靶基因，見圖4A。雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，過表達miR-145顯著抑制PDCD42野生型質粒內熒光強度（P＜0.01），見圖4B，而突變型質粒熒光強度與對照組無顯著差異。同時，Western blot檢測結果顯示，在NE-4C細胞中過表達miR-145顯著抑制PDCD4的表達水平（P＜0.01），見圖4C。以上實驗結果表明miR145靶向下調PDCD4的表達水平。

圖3 過表達miR-145抑制H2O2 誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應Fig.3 Overexpression of miR-145 inhibits H2O2-induced apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

圖4 mi-R145靶向下調PDCD4的表達水平Fig.4 miR-145 targets down-regulation of PDCD4

2.5 miR-145靶向下調PDCD4抑制H2O2誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應

Westernbolt結果表明，與NC組相比，敲降PDCD4顯著下調NE-4C細胞中PDCD4的表達水平（P＜0.01），圖5A；而同時敲降miR-145和PDCD4中PDCD4的表達水平與對照組無統計學意義。RT-qPCR結果表明，與NC組相比，在轉染sh-PDCD4的NE-4C細胞中采用H2O2處理后，IL-1β、IL-6及TNF-α 的表達水平顯著下調（P＜0.05或P＜0.01），圖5B，同時轉染miR-145 inhibitor和sh-PDCD4與NC組無顯著差異。流式細胞儀檢測結果表明，與NC組相比，轉染sh-PDCD4能顯著抑制H2O2誘導的NE-4C細胞凋亡（P＜0.05），圖5C，在回復實驗中同時轉染miR-145 inhibitor和sh-PDCD4中細胞凋亡水平與NC組差異無統計學意義。以上實驗結果表明，過表達miR145靶向下調PDCD4抑制H2O2誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應。

圖5 miR145靶向下調PDCD4抑制H2O2 誘導NE-4C細胞凋亡和炎性反應Fig.5 Own-regulation of PDCD4 by miR145 inhibits H2O2-induced apoptosis and inflammatory response in NE-4C cells

3 討論

缺血性腦卒中是導致我國居民發生腦部并發癥及死亡的主要原因，大約有30%的腦卒中患者永久喪失勞動力[7-8]。近年來研究證實，腦部供血動脈狹窄或閉塞，造成腦供血不足導致神經干細胞等發生非正常凋亡以及分泌炎性因子（如IL-1家族、IL-6、TNF-α 等）進一步導致腦組織發生炎癥和壞死[9]，進而造成缺血性腦卒中進一步發展[10]。本研究采用H2O2處理小鼠神經干細胞NE-4C構建腦卒中細胞模型，發現炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α 水平顯著增加，NE-4C細胞凋亡水平也顯著上升。

近年來，研究證實，許多非編碼內源性小RNA（miRNA）在缺血性腦卒中后表達發生變化[11]，并在轉錄或轉錄后水平參與調控缺血性腦卒中的發展進程，此外，也有研究證實miRNA在神經干細胞凋亡和炎性反應中起著至關重要的作用，如下調miR-19a抑制神經干細胞凋亡緩解缺血性腦卒中的進展[12]；高表達miR-195能抑制神經干細胞炎性相關因子IL-1β、IL-6、TNF-α 等的分泌進而保護缺血性腦卒中引起的腦損傷[13]。miR-145位于5號染色體5q32-33，是一類腫瘤轉移抑制因子，同時有研究發現，miR-145在缺血性腦卒中過程中低表達，并發揮重要調控作用，如上調miR-145通過調控MAPK途徑在缺血性腦卒中保護神經干細胞[14]。本研究發現，miR-145在H2O2處理的NE-4C細胞中表達水平顯著下調，過表達miR-145能顯著下調H2O2引起的炎性相關因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達，并抑制NE-4C細胞的凋亡。

PDCD4是一類細胞死亡因子，其主要作用可通過MA-3片斷與靶基因的mRNA編碼區結合阻斷翻譯過程，進而影響細胞增殖、凋亡等生物學行為[15]，同時，研究發現PDCD4能抑制抗炎因子IL-10的翻譯，導致IL-10表達降低，促進IL-6等炎性因子分泌從而介導炎癥發生[16-17]，在腫瘤、肥胖、心血管疾病發生發展中參與重要調控[18-20]。在缺血性腦卒中發展中，PDCD4上調并促進了神經干細胞NE-4C的凋亡。本研究通過生物信息學發現PDCD4是miR-145潛在靶基因，miR-145可通過靶向PDCD4，進而抑制H2O2引起的NE-4C細胞炎性相關因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達和細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過NE-4C細胞發現并證實miR-145靶向下調PDCD4可緩解缺血性腦卒中引起的神經干細胞NE-4C凋亡和炎性反應。