冠心病患者外周血單核細(xì)胞中miR-125a-5p、miR-193b的表達(dá)

戴海龍，張 星，潘 云，馮曉嵐，盧祥婷，光雪峰，尹小龍

（云南省心血管疾病重點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院心內(nèi)科，云南昆明 650051）

冠心病（coronary heart disease，CHD）指粥樣硬化斑塊在冠狀動(dòng)脈形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈的管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺氧、缺血，從而引起的心臟病。冠心病最為重要的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），它是一種進(jìn)展緩慢的非特異性的炎性疾病。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不同過程中。巨噬細(xì)胞有著不同的分化類型，其中M1型（經(jīng)典活化型），它可表達(dá)大量炎性因子，具有促炎作用[1]，M 2型（替代活化型）則表達(dá)炎癥抑制因子，抑制炎癥反應(yīng)[2]。MicroRNAs（miRNA）是一類非編碼的內(nèi)源性小RNA，長(zhǎng)度約為20-25個(gè)核苷酸，與靶基因配對(duì)結(jié)合后在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)[3]。有研究[4-6]顯示單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化中miR-193b表達(dá)升高；miR-125a-5p在抑制M1型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞中起著重要作用。筆者在冠心病患者外周血單核細(xì)胞中檢測(cè) miR-125a-5p、miR-193b水平，探討它們與冠心病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院心血管內(nèi)科于2018年9月至12月期間住院的冠心病患者，及排除冠心病的患者為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～75歲，經(jīng)心電圖、心肌標(biāo)志物及冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈CT血管造影檢查確診[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心律失常、心肌炎、心臟瓣膜病、心包疾病、腦卒中、陳舊性心肌梗死、風(fēng)濕免疫疾病、甲狀腺疾病、血液腫瘤疾??；肺動(dòng)脈栓塞、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾??；結(jié)核、肝炎、HIV感染；嚴(yán)重肝腎功能不全及使用激素患者。

最終共有102例研究對(duì)象入選，其中對(duì)照組25例（A組），穩(wěn)定型心絞痛組22例（B組），不穩(wěn)定型心絞痛組26例（C組），急性心肌梗死組29例（D組）。本研究通過了昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 血液樣本采集

標(biāo)本采集研究對(duì)象于入院當(dāng)日或次日清晨用枸櫞酸鈉抗凝管采集空腹靜脈血4 mL，盡快置入4℃冰箱保存待測(cè)，避免樣本在室溫放置超過4 h及反復(fù)凍融。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

miR-125a-5p、miR-193b含量檢測(cè)采用密度梯度離心的方法分離外周血單核細(xì)胞。Trizol一步法提取總 RNA。應(yīng) 用 All－in－One TM miRNAqRT－PCR Detection Kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件：37℃60 min，85 ℃5 min，4 ℃10 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃10 min，95 ℃10 s、61℃20 s及72℃30 s，后面這3步共40個(gè)循環(huán)。選取U6作為內(nèi)參，miRNA原始表達(dá)水平由miRNA到達(dá)反應(yīng)閾值的循環(huán)數(shù)表示。采用2-△△Ct計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料比較

四組間年齡、性別、合并高血壓、糖尿病比例、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）高于A組、B組及C組（P＜0.05），見表1。

2.2 miR-125a-5p、miR-193b在不同組別中的表達(dá)差異

miR-125a-5p在四組間表達(dá)水平分別為：A組：（1.0±0.55），B組：（0.57±0.56），C組：（0.37±0.21），D組：（0.36±0.28）。與A組比較，miR-125a-5p在B、C、D組中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與B組比較，miR-125a-5p在C、D組中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；miR-125a-5p在C組和D組中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miR-193b在四組間表達(dá)水平分別為：A組：（1.0±0.57），B組：（0.53±0.82），C組：（0.26±0.25），D組：（0.25±0.24）。與A組比較，miR-193b在B、C、D組中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與B組比較，miR-193b在C、D組中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；miR-193b在C組和D組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 四組間臨床資料比較（）Tab.1 A comparison of basic data among the four groups（）

表1 四組間臨床資料比較（）Tab.1 A comparison of basic data among the four groups（）

與A組、B組、C組比較，**P ＜0.01。

表2 miR-125a-5p、miR-193b表達(dá)水平Tab.2 Expression level of miR-125a-5p and miR-193b

3 討論

冠心病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病最為重要的病理基礎(chǔ)，是一種進(jìn)展緩慢的非特異性炎性疾病。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、進(jìn)展及破裂中起著重要的作用。在斑塊病變進(jìn)展過程中，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，并決定動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和穩(wěn)定性[8]。巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈壁內(nèi)的聚集是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的一個(gè)顯著特征。巨噬細(xì)胞受各種斑塊微環(huán)境刺激的影響，如氧化脂質(zhì)、細(xì)胞因子和衰老紅細(xì)胞，從而極化為兩種主要表型，即促炎M1和抗炎M2巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，具有促炎作用。而活化的M2型巨噬細(xì)胞則具有抗炎作用。M1型巨噬細(xì)胞與粥樣硬化斑塊形成相關(guān)，是不穩(wěn)定斑塊的顯著表型，而M2型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)斑塊纖維帽生成，進(jìn)而增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性。巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)可能是動(dòng)脈粥樣硬化治療的有效途徑[9]。

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度為20-25個(gè)核苷酸。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)（3'-UTR），促進(jìn)靶基因的降解或沉默，從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[10-11]。研究[12-14]表明miRNA與心血管疾病密切相關(guān)。Hao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在人非冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中的 miR-199a/b-3p、miR-155和miR-125a-5p表達(dá)水平比冠脈粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)水平高。張鳳香等[16]研究顯示，miR-125a-5p可以調(diào)節(jié)ACAT-1、ABCA1、SR-A1等因子表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。有研究[4-6]顯示miR-125a-5p在促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞，抑制M1型巨噬細(xì)胞中起重要作用，miR-193b M2型巨噬細(xì)胞分化中表達(dá)升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組的miR-125a-5p、miR-193b表達(dá)水平降低。與穩(wěn)定型心絞痛組相比，不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組miR-125a-5p、miR-193b表達(dá)水平降低。這提示miR-125a-5p、miR-193b與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成以及穩(wěn)定性有關(guān)。而在不穩(wěn)定型心絞痛與急性心肌梗死組間miR-125a-5p、miR-193b表達(dá)無差異，可能為不穩(wěn)型心絞痛與急性心肌梗死有著共同的病理生理學(xué)機(jī)制，即不穩(wěn)定斑塊的破裂。但在病程的不同進(jìn)展、不同階段中，miR-125a-5p、miR-193b的表達(dá)是否會(huì)存在動(dòng)態(tài)變化，仍有待進(jìn)一步觀察。

綜上所述，miR-125a-5p、miR-193b可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，可能為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新靶點(diǎn)。然而，具體的作用及相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。